楊國韜，蘭 艷

（1. 黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院），湖北 黃石 435000； 2. 腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435000）

高效液相色譜法研究甲氨蝶呤和特立氟胺在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)

楊國韜1，2，蘭 艷1，2

（1. 黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院），湖北 黃石 435000； 2. 腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435000）

采用高效液相色譜法（HPLC）建立大鼠血漿中的甲氨蝶呤（MTX）和特立氟胺（TEF）的檢測方法，研究大鼠體內(nèi)MTX和TEF的藥代動力學(xué)。色譜柱為Aglient ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：50 mM 乙酸鈉溶液—乙腈（體積比85:15）；檢測波長為300 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.5 mL/min。大鼠采用靜脈注射給藥，藥動學(xué)參數(shù)采用DAS 2.0計算。該HPLC方法可用于大鼠血漿中MTX和TEF的同時測定，方法準(zhǔn)確，快速，靈敏度高，重復(fù)性好，適用于大鼠體內(nèi)MTX和TEF藥物代謝動力學(xué)的研究。

高效液相色譜法；甲氨蝶呤；特立氟胺；大鼠；藥代動力學(xué)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性的多系統(tǒng)的具有侵蝕性的自身免疫性疾病，臨床主要表現(xiàn)為對稱性多關(guān)節(jié)炎，其癥狀多見關(guān)節(jié)腫痛、功能障礙、關(guān)節(jié)僵硬和畸形，最終可導(dǎo)致殘疾。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，嚴(yán)重威脅著人類健康［1，2］。目前，臨床上經(jīng)常采用甲氨蝶呤（MTX）和來氟米特（LEF）聯(lián)合用藥的方式來對RA進(jìn)行治療［3］。MTX為常用藥物，不良反應(yīng)較多，難以長時間持續(xù)使用，而來氟米特（LEF）是一種相對高效低毒的新型抗炎和免疫調(diào)節(jié)抗RA藥物臨床療效顯著［4］。本品為前藥，其進(jìn)入體內(nèi)后在腸和肝中代謝成為活性產(chǎn)物特立氟胺（TEF），后者可抑制嘧啶核苷合成所需的二氫乳清酸脫氫酶。大多數(shù)研究都采用監(jiān)測TEF的方法，來評價LEF療效及作用特點(diǎn)［4］。因此本文選擇MTX和TEF作為研究對象。

本文擬通過HPLC法建立大鼠血漿中MTX和TEF濃度檢測方法，并探討MTX和TEF在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特點(diǎn)［5，6］。通過該研究可對進(jìn)一步評價MTX和TEF聯(lián)合應(yīng)用治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)理，對藥物的安全應(yīng)用具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 動物

普通級雄性SD大鼠6只，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物合格證號為SCXK（京）2010-0016。

1.2 藥品與試劑

甲氨蝶呤（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20055198）；特立氟胺（湖北恒綠源科技有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；乙酸鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為純凈水。

1.3 儀器

日立 L-7000型高效液相色譜系統(tǒng)，配有L-7110 型泵，L-7200 型自動進(jìn)樣器，L-7420 型UV檢測器； Sigma 3K15 高速低溫離心機(jī)（Sigma公司）；DCY-24S水浴式氮吹儀（青島?？苾x器有限公司）；BS110S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；XW-80A 旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；KQ 500DE型數(shù)控超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Aglient ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相：50 mM 乙酸鈉溶液—乙腈（體積比85:15）；檢測波長為300 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.5 mL/min。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

精密秤取 MTX對照品適量，用稀鹽酸溶解后加純凈水稀釋至刻度，配制成400 μg/mL貯備液；精密秤取TEF對照品適量，用甲醇溶解并定容，配制成400 μg/mL貯備液。臨用前將兩個儲備液等量混合，用甲醇逐級稀釋，配制成MTX和TEF濃度均為2.0、5.0、10、20、100、和200 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。再分別取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 μL加入到90 μL空白大鼠血漿中，使血漿中MTX和TEF濃度均為0.2、0.5、1.0、2.0、10、和20 μg/mL。配制過程注意避光。

1.4.3 血漿樣品處理

取大鼠血漿樣品0.1 mL，加入沉淀劑（乙腈：甲醇1∶1）0.6 mL，充分渦旋振蕩1 min，1 4000 r/min離心10 min，取上清0.5 mL置1.5 mL離心管中，氮?dú)獯蹈桑?.1 mL流動相復(fù)溶，進(jìn)樣50 μL進(jìn)行分析。

1.4.4 大鼠藥動學(xué)

6只雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)前一天至少禁食12 h，給藥前將MTX和TEF混合，尾靜脈注射給藥。MTX和TEF的給藥劑量分別為2 mg/kg和1 mg/kg。分別于給藥前和給藥后0.083、0.5、1、2、4、8、12和24 h眼球靜脈叢取血0.3 mL置于肝素化的離心管中。3 000 r/min離心15 min，取血漿-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

采用DAS 2.0軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)，計數(shù)資料以mean ± SD表示， Origin 8.0繪制藥物血漿濃度-時間曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

在上述色譜條件下，MTX和TEF的保留時間分別為6.52 和8.75 min?？瞻籽獫{、空白血漿中加入MTX和TEF標(biāo)準(zhǔn)溶液及靜注給藥后大鼠血漿色譜圖（圖 1）表明在該色譜條件下，空白基質(zhì)中的雜質(zhì)不干擾MTX和TEF的測定。

以MTX濃度（X）為橫坐標(biāo)，MTX峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，做線性回歸，得相應(yīng)的回歸方程 Y = 146.31X -119.65，r = 0. 9952，顯示MTX血藥濃度在0.2～20 μg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。定量下限為0.2 μg/mL。以TEF濃度（X）為橫坐標(biāo)，TEF峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，做線性回歸，得相應(yīng)的回歸方程Y = 216.48X +88.32，r = 0. 9964，顯示TEF血藥濃度在0.2～20 μg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。定量下限為0.2 μg/mL。

低、中、高三個濃度MTX和TEF樣品（0.2、2.0和20 μg/mL）的日內(nèi)RSD和日間RSD均小于10%，回收率和準(zhǔn)確度在85%～115%之間（表1和表2）。MTX和TEF樣品在室溫放置6 h和進(jìn)樣倉放置24 h條件下保持穩(wěn)定（表3）。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示該方法符合生物樣品分析要求。

圖1 大鼠血漿色譜圖Fig.1 Chromatograms for rat plasma

表1 大鼠血漿中MTX測定方法的回收率、精密度和準(zhǔn)確度Table 1 Recovery， precision and accuracy of the assay method for MTX in rat plasma （n= 5）

表2 大鼠血漿中TEF測定方法的回收率、精密度和準(zhǔn)確度Table 2 Recovery， precision and accuracy of the assay method for TEF in rat plasma （n= 5）

表3 大鼠血漿中MTX和TEF的穩(wěn)定性Table 3 Stability of MTX and TEF in rat plasma （mean±SD，n=5）

2.2 大鼠藥動學(xué)

大鼠尾靜脈注射MTX和TEF后的藥物血漿濃度-時間曲線和主要的藥代動力學(xué)參數(shù)分別見圖 2和表4。

表4 大鼠靜注MTX和TEF后的主要藥代動力學(xué)參數(shù)Table 4 Pharmacokinetic parameters of MTX and TEF after iv administration in rats （mean ± SD， n=6）

3 結(jié) 論

本文建立的HPLC方法準(zhǔn)確，快速，靈敏度高，重復(fù)性好，能夠?qū)Υ笫笱獫{中MTX和TEF的濃度進(jìn)行同時測定，適用于大鼠體內(nèi)MTX和TEF藥物代謝動力學(xué)的研究以及其它方面的代謝及藥動學(xué)研究。

本研究得出 MTX的主要藥動參數(shù)為Cmax為（3627.46 ± 472.16）ng/mL，t1/2z為（2.54 ± 0.23）h，AUC為（6233.42 ± 703.70）ng·h/mL，MRT 為（2.26 ± 0. 35）h，CLz為（0.18 ± 0.02）h。TEF的主要藥動參數(shù)為Cmax為（12036.42 ± 1736.53）ng/mL，t1/2z為（18. 43 ± 1.67）h，AUC為（156397.33 ± 9913.84）ng·h/mL，MRT 為（16.56 ± 1.49）h，CLz為（0.035 ± 0.002）h。

圖2 MTX和TEF在大鼠體內(nèi)的藥時曲線Fig.2 The mean concentration-time curves of MTX and TEF in rats （mean ± SD， n=6）

［1］ 鐘南山，陸再英.內(nèi)科學(xué)［M］.第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：848-851.

［2］ Mclnnes I B， Schett G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis ［J］. N Engl J Med， 2011， 365 （23）: 2205-2219.

［3］ 楊德才，鄭新春，王光輝，等.來氟米特和甲氨蝶呤聯(lián)合用藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的療效［J］.中國新藥與臨床雜志，2004，1（23）：24-26.

［4］ 李慧慧，呂新亮.甲氨蝶吟聯(lián)合來氟米特治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的新進(jìn)展［J］.風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2012，1（3）：61-63.

［5］ 姚瑤，丁從珠，葛衛(wèi)紅.高效液相色譜法測定甲氨蝶呤對來氟米特在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（23）：1929-1931.

［6］ 陳珊珊，王婷，朱騰偉，等.皮下注射甲氨蝶呤原位凝膠的兔體內(nèi)藥動學(xué)［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2014，45（5）：466-469.

Pharmacokinetic Research of Methotrexate and Teriflunomide in Rats by HPLC

YANG Guo-tao1，2， LAN Yan1，2
（1. Department of Pharmacy， Huangshi Central Hospital， Affiliated Hospital of Hubei Polytechnic University， Hubei Huangshi 435000， China； 2. Hubei Key Laboratory of Kidney Disease Pathogenesis and Intervention， Hubei Huangshi 435000， China）

A HPLC method was established for determination of plasma concentration of methotrexate and teriflunomide and study on the pharmacokinetics of methotrexate and teriflunomide in rats. The chromatographic conditions were as follows： a Aglient ZORBAX SB-C18 chromatographic column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） was used at 30 ℃. The mobile phase consisted of 50 mM sodium acetate solution-acetonitrile （85：15， v/v） and was pumped at a flow rate of 1.5 mL·min-1. The determination wavelength was 300 nm. Rats were received a single dose of drugs by intravenous injection. The pharmacokinetic parameters of methotrexate and teriflunomide were calculated with DAS 2.0 software. The HPLC method for determining methotrexate and teriflunomide concentration in rat plasma is accurate， rapid， simple， sensitive and repeatability and can be applied to pharmacokinetic studies of methotrexate and teriflunomide.

HPLC； Methotrexate； Teriflunomide； Rats； Pharmacokinetics

TQ 460

A

1671-0460（2015）12-2916-03

2015-08-06

楊國韜（1977-），男，湖北黃石人，主管藥師，1995年畢業(yè)于黃石衛(wèi)校藥劑專業(yè)，研究方向：從事臨床藥學(xué)工作。

蘭艷（1986-），女，初級藥師，研究方向：ICU臨床藥師。E-mail： yanlan86@hotmail.com。