原 平，張仁杰，李 焰，史運(yùn)光

冠心病患者血漿miR-126和miR-143表達(dá)水平變化研究

原 平1，張仁杰2，李 焰1，史運(yùn)光1

（1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，邯鄲 056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院，邯鄲056002）

目的：研究血漿miR-126、miR-143在急性心肌梗死AMI和不穩(wěn)定型心絞痛UAP、穩(wěn)定型心絞痛（SAP）及非冠心病患者（NCHD）中濃度的變化。方法：收集急性心肌梗死22例和不穩(wěn)定型心絞痛31例，穩(wěn)定型心絞痛患者（23例）及非冠心病患者（20例）共96例，采集入院后24小時(shí)內(nèi)的清晨空腹靜脈血標(biāo)本，以miR-39為參照基因，Trizol法提取血漿總microRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用real-time qPCR檢測(cè)血漿中microRNA的相對(duì)表達(dá)量，分析microRNA相對(duì)表達(dá)量各組中的變化。結(jié)果：1. miR-126：與NCHD組比較，SAP組表達(dá)量增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，AMI、UAP組有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2. miR-143：與NCHD組比較，UAP、SAP組無(wú)差異，AMI組明顯升高；AMI組高于UAP和SAP組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；結(jié)論：1. miR-126 在SAP組較AMI、UAP、NCHD均明顯升高，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明有可能在AS發(fā)病過(guò)程中具有保護(hù)作用。2. miR-143在AMI中高表達(dá)，且與UAP、SAP、NCHD相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明miR-143在某種程度上有可能作為AMI時(shí)的臨床檢測(cè)指標(biāo)之一。

動(dòng)脈粥樣硬化；miR-126；miR-143；冠心病

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在各種危險(xiǎn)因素（高血壓、高血糖、高血脂、吸煙、感染等）的作用下血管局部產(chǎn)生的一種過(guò)度的慢性炎性增生反應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞始終是構(gòu)成動(dòng)脈粥樣硬化灶的三要素［1］。MicroRNA［2］是一組生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的非編碼的小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在不同的生物、不同組織、細(xì)胞及不同炎癥狀態(tài)下表達(dá)量有所不同，近期研究［3］顯示MircoRNA在心血管系統(tǒng)中高度表達(dá)，多種MicroRNA在上述細(xì)胞上特異性表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的多種功能參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過(guò)程，在動(dòng)脈粥樣硬化中起重要的作用。

miRNA 作為疾病診斷的標(biāo)志物的研究成為最近miRNA 研究的一個(gè)新的熱點(diǎn)［6］，近日的某些研究相繼發(fā)現(xiàn)miR-1、miR-499 和miR-208a等在心肌梗死的大鼠血漿中明顯升高，這些miRNA可能作為心肌梗死的檢測(cè)標(biāo)志物［4-6］。

但是，在人體冠心病患者發(fā)生急性冠脈綜合征（ACS）時(shí)分別在血漿中內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞特異性表達(dá)的miR-126、miR-143等的的表達(dá)水平仍不清楚。

1　資料與方法

1.1一般資料 入選2011年9月～2012年8月河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，入院時(shí)診斷為急性冠脈綜合征、穩(wěn)定型心絞痛，按急性冠脈綜合征、穩(wěn)定型心絞痛給予相應(yīng)處理，并行冠脈造影的96例患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有急性或慢性感染性疾病者；②惡性腫瘤患者；③近期行手術(shù)治療或患過(guò)感染性疾?。?周內(nèi)）；④近期有其他活動(dòng)性出血病史（2周內(nèi)）；⑤自身免疫性疾病患者；⑥嚴(yán)重肝腎功能不全者。

1.2研究方法

1.2.1分組 按病人癥狀、心電圖、心肌酶譜、心臟超聲及冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果將研究對(duì)象分為：急性冠脈綜合征組（53例）（急性心肌梗死亞組22和不穩(wěn)定性心絞痛亞組31）穩(wěn)定型心絞痛組（23例）和非冠心病組（20例）。

入院后24小時(shí)內(nèi)的清晨空腹靜脈血標(biāo)本，以miR-39為參照基因，Trizol法提取總microRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用real-time qPCR檢測(cè)血漿中microRNA的相對(duì)表達(dá)量，分析microRNA相對(duì)表達(dá)量。（1）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)：所有入選患者入院后當(dāng)天隔夜禁食8～10小時(shí)，次日晨起抽取肝素鈉抗凝靜脈血5ml，離心10分鐘得血漿和血細(xì)胞。血漿-80℃保存待行檢測(cè)水平；待行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及real-time qPCR檢測(cè)miRNA126、miRNA143的表達(dá)量。（2）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13 .0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)各研究組間采用方差分析及LSD兩樣本間比較等；real time-qPCR的結(jié)果分析，以miR-39為參照基因，采用2-△△Ct的方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)的量，然后再進(jìn)一步采用方差分析及T檢驗(yàn)進(jìn)行各組間比較；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MicroRNA的相對(duì)表達(dá)量 miRNA126、miRNA143的相對(duì)表達(dá)水平：miR-126：與NCHD組比較，SAP組表達(dá)量增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），AMI、UAP組有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

miR-143：與NCHD組比較，UAP、SAP組無(wú)差異，AMI組明顯升高（P＜0.05）；AMI組高于UAP和SAP組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表2　AMI患者與UAP、 SAP 、NCHD患者血漿中MicroRNA的相對(duì)表達(dá)量

3　討論

內(nèi)皮細(xì)胞功能不良不僅是形成動(dòng)脈粥樣硬化病變的始動(dòng)因素，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性也有重要影響。最近研究Wang等［7］在體內(nèi)敲掉老鼠的MicroRNA126，造成血管完整性的丟失及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，參與血管形成能力的缺陷。Harris［8］發(fā)現(xiàn) VCAM-1是miR-126 的靶基因，敲低miR-126 的水平會(huì)在一定程度上導(dǎo)致TNF-a誘導(dǎo)的VCAM-1 表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞的黏附聚集。因此，miR-126可能通過(guò)抑制VCAM-1 的表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。Zernecke［9］發(fā)現(xiàn)凋亡內(nèi)皮細(xì)胞釋放凋亡小體，其中含有miR-126，被周圍的血管細(xì)胞吞噬，miR-126誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞源性因子12（CXCL12）表達(dá)，從而限制As 的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)中miR-126：與NCHD組比較，AMI、UAP、SAP組表達(dá)量均不同程度的增高，但只有SAP組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；可能是SAP時(shí)miR-126有充足時(shí)間在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞，并通過(guò)抑制VCAM-1 的表達(dá)在AS中起到保護(hù)性作用而出現(xiàn)的代償性增高，進(jìn)一步起到穩(wěn)定粥樣斑塊的作用，而AMI、UAP時(shí)斑塊急性破裂，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的miR-126無(wú)緩沖時(shí)間來(lái)反應(yīng)性增高，并在此過(guò)程中伴有內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，可能會(huì)有少量miR-126釋放，而SAP組較NCHD組的顯著性升高也進(jìn)一步說(shuō)明miR-126在AS中可能存在的保護(hù)性作用，但具體經(jīng)過(guò)何種方式及途徑釋出有待于進(jìn)一步的研究。

AS病灶內(nèi)主要細(xì)胞成分為血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，AS形成后是否導(dǎo)致臨床癥狀的出現(xiàn)，不但取決于動(dòng)脈管腔的狹窄程度，更重要的是斑塊本身是否穩(wěn)定。而不穩(wěn)定斑塊均具有相對(duì)體積大且質(zhì)軟的脂質(zhì)核心，纖維帽比較薄弱，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而纖維帽變薄通常認(rèn)為是破裂的前兆，也是斑塊不穩(wěn)定的標(biāo)志，其原因歸根結(jié)底是細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失衡，內(nèi)膜的平滑肌細(xì)胞是合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源。

miR-143在血管平滑肌細(xì)胞中特異表達(dá)，Cordes等［10］確認(rèn)了miR-143 和miR-145分別靶向促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因Elk1 和Kfl4，并通過(guò)體外試驗(yàn)證明了miR-143和miR-145通過(guò)抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的分化，在平滑肌細(xì)胞的命運(yùn)決定和可塑性方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用。AMI是AS不穩(wěn)定斑塊的慢性炎癥的超急性爆發(fā)過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)中平滑肌細(xì)胞特異表達(dá)的miR-143：AMI組均高于UAP、SAP、NCHD組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），表明miR-143可能作為AMI的又一臨床檢測(cè)指標(biāo)，可能由于AMI時(shí)平滑肌細(xì)胞大量凋亡使纖維帽變薄、斑塊破裂時(shí)miR-143釋放入血，但具體經(jīng)過(guò)何種方式、何種途徑進(jìn)入外周血液尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究；UAP組較SAP、NCHD組比較呈現(xiàn)升高趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是UAP發(fā)作是AS斑塊易損部位（肩部）少量破裂或者出現(xiàn)裂紋所致UAP較AMI時(shí)平滑肌細(xì)胞的凋亡數(shù)量相對(duì)較少導(dǎo)致無(wú)差異，本實(shí)驗(yàn)仍需要在動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究證實(shí)。

［1］ Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease［J］. N Engl J Med，1999， 340（2）: 115-126.

［2］ Bartel DP. MicroRNAs: genomics， biogenes is， mechanism， and function［J］. Cell， 2004， 16（2）: 28l-297.

［3］ Landgraf P， Rusu M， Sheridan R， et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell， 2007，129（7）: 140 1-14.

［4］ Ji X， Takahashi R， Hiura Y， et al. Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury. Clin Chem， 2009， 55（11）: 1944-9.

［5］ Wang GK， Zhu JQ， Zhang JT， et al. Circulating microRNA: a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans. Eur Heart J， 2010， 31（6）: 659-666.

［6］ T， Naka Adachi nishi M， Otsuka Y， et al. Plasma microRNA 499 as a biomarker of acute myocardial infarction. Clin Chem， 2010.

［7］ Wang S， AuroraAB， Johnson BA， et a. l The endothelial specific microRNA miR-126 governs vascular integrity and angiogenesis ［J］. Dev Cell， 2008， 15 （ 2）: 261-271.

［8］ Harr is TA， Y amakuch iM， F erlitoM， e t a. l MicroRNA-126 regulates endothelial expression o f vascular cell adhesion molecule 1 ［J］. Pro c Na tl A cad Sci USA， 2008， 105 （ 5）: 1 516-521.

［9］ ZerneckeA， B idzhekov K， N oe lsH， et a. l Deliv ery of m icroRNA -126 byapoptotic bodies induces CXCL12 dependent vascular protection ［J］. Sci Signal， 2009， 2 （100）: ra81.

［10］ Cordes KR， Sheehy NT， White MP， et al. miR-145 and miR-143 regulate smooth muscle cell fate and plasticity. Nature， 2009， 460（7256）: 705-710.

Investigation of changes and relations between the plasma miR-126 and miR-143 in patients with Coronary Heart Disease

Yuan Ping， Zhang Ren-jie， Li Yan， Shi Yun-guang
（Affiliated Hospiral of Hebei University of Engineering， Handan 056002， China）

Objective To investigate the expression of peripheral plasma miR-126， miR-143 in patients with coronary artery disease（CAD） and NCHD. Methods We collected the fasting venous blood samples of 96cases， with acute myocardial infarction 22cases， 31cases of unstable angina pectoris，23cases of stable angina pectoris（SAP）and 20 cases of non-coronary heart disease （NCHD）， within 24 hours since their admission. We measured the relative expression of microRNA in their plasma by real-time polymerase chain reaction （PCR）， and analysed the microRNA parameters in four groups. Results 1.miR-126 expression in SAP is higher than NCHD group， with statistical significance；the expression in AMI and UAP is higher than NCHD group，but with no statistical significance. 2.miR-143 expression in AMI group was significantly higher than UAP，SAP and NCHD groups， with statistical significance；there were no significant difference among UAP ，SAPand NCHD groups，with no statistical significance Conclusions 1.miR-126 may be a protection factor in AS，it would be a novel method to delay or prevent AS.2.miR-143 expression in plasma may be a another novel biomarker for AMI.

Atherosclerosis； microRNA -126； microRNA -143； Coronary heart disease

R541.4

A

1673-016X（2015）06-0103-03

2015-02-02

原平，E-mail: 18031028122@189.cn