葉文斌

（隴南師范高等專科學(xué)校生化系，甘肅成縣742500）

效應(yīng)面法與酶法聯(lián)用提取天麻素和天麻多糖的優(yōu)化工藝研究

葉文斌

（隴南師范高等?？茖W(xué)校生化系，甘肅成縣742500）

通過效應(yīng)面法與酶法聯(lián)用工藝提取天麻中的活性物質(zhì)。以天麻素和天麻多糖含量為評價指標，用單因素方差分析法研究酶解溫度、酶解濃度和pH對提取天麻素和天麻多糖含量的影響；采用效應(yīng)面法和對酶法聯(lián)用提取工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，最佳優(yōu)化工藝為：酶解溫度為54.36℃，酶解濃度為0.09 g和pH為4.73，該工藝條件易于控制、工藝簡單，成本低，在此條件下，天麻酶解后天麻素的最高含量為7.281 6 mg/g，天麻多糖的最高含量為38.336 1%。

效應(yīng)面法；酶法；天麻素；天麻多糖；優(yōu)化工藝

天麻為蘭科天麻屬植物天麻（Gastrodia elata Blume）的根莖，是我國名貴的中藥之一［1］。天麻的主要有效成分之一為天麻素，即對羥基苯-β-D-吡喃葡萄糖甙，天麻素有鎮(zhèn)靜和安眠等作用，為常用安眠鎮(zhèn)靜藥［2-3］，有研究表明天麻素對動脈粥樣硬化導(dǎo)致的錐基底動脈供血不足療效顯著［4］。此外還對心臟缺血有保護作用、具有溫和的降壓作用、拮抗興奮性氨基酸神經(jīng)毒性以及對模擬腦缺血再灌注損傷星形膠質(zhì)細胞有良好的保護作用［5-7］。隨著植物多糖在保健和藥理方面的研究和應(yīng)用關(guān)注增多，研究天麻多糖在清除自由基、降血壓、抗眩暈、抑菌方面具有獨特療效［8］。近年來有關(guān)天麻素和天麻多糖提取工藝研究的報道較多，但傳統(tǒng)提取工藝時間長提取率低［4，9-10］，單獨用復(fù)合酶法提取天麻中天麻素提取率相對較高，但是其耗時亦較長［11］。而且在提取工藝的優(yōu)化時只是對單一成分進行優(yōu)化設(shè)計，使得天麻資源浪費嚴重。為此，本實驗用酶法和響應(yīng)面法聯(lián)用，同時對天麻素和天麻多糖兩種主要活性成分進行提取工藝優(yōu)化研究，為節(jié)約天麻資源以及天麻的綜合開發(fā)利用提供實驗技術(shù)。

1材料與方法

1.1儀器與材料

電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司；SK5200H超聲波清洗儀：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海千載科技有限公司；TGL-16G高速臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV759紫外-可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DRT-TW型調(diào)溫電熱套：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DHG-9036A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精密科學(xué)儀器有限公司；1100高效液相色譜色譜儀及檢測器、TC-C18色譜柱：Agilent公司。

天麻由甘肅省隴南市康縣康麻種植基地提供；天麻素標準品購于貴州迪大科技生物有限公司；苯酚、濃硫酸、葡萄糖（sigam公司），工業(yè)用復(fù)合酶，酶活構(gòu)成為：β-葡聚糖酶≥300萬kat/mL，纖維素酶≥40萬kat/mL，木聚糖酶≥260萬kat/mL，果膠酶≥2萬kat/mL）和氏璧生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1天麻多糖和天麻素的提取流程

將天麻塊莖在50℃烘干后將其粉碎，過40目篩，用無水乙醇回流脫脂，再在50℃時干燥，然后加入一定量的水，在一定溫度下添加相應(yīng)的復(fù)合酶進行一定時間的酶解提取，提取液經(jīng)過減壓濃縮得濃縮液，加3倍體積乙醇醇析得粗多糖沉淀，抽濾，沉淀用甲醇多次洗滌，冷凍干燥后得粗多糖樣品；在減壓濃縮蒸餾出來的液體回收，并和將析后抽濾出來的液體合并，減壓回收乙醇和甲醇，使濾液成膏，冷凍干燥后備用，待用時加入適量的蒸餾水溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，HPLC法進樣測定天麻素含量。

1.2.2天麻多糖含量的測定方法

本實驗采用苯酚-硫酸法［11-12］測定總的天麻多糖含量。本實驗先把葡萄糖用苯酚、硫酸試劑處理后，進行紫外掃描，在489 nm處有最大吸收；再利用標準糖濃度和其用苯酚、硫酸試劑處理后在489 nm處的吸光度制作標準曲線，再測定待測樣品溶液的吸光度，然后根據(jù)回歸方程計算相應(yīng)的濃度從而求出多糖含量。苯酚試液的配制：取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾，收集182℃餾分，用時稱取6 g，加水溶解，定容于100 mL棕色容量瓶（臨用前新配）。取多糖干品10.0 mg，用蒸餾水定容于100 mL容量瓶。吸取1.0 mL于帶塞試管中，（按上述步驟操作，測其吸光度，以標準曲線計算精天麻多糖含量。天麻多糖的提取率（%）=樣品中多糖的含量稀釋倍數(shù)/樣品干重×100%。

1.3天麻多糖和天麻素的單因素實驗

分別稱取1.0 g天麻藥材粉末多份，分別置于250 mL錐形瓶中，用100 mL蒸餾水混勻，調(diào)節(jié)pH至4.8，備用。用時添加不同酶劑量攪拌均勻后用保鮮膜封口，置于50℃恒溫搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100 r/min，酶解24 h，以蒸餾水為空白對照，實驗重復(fù)5次。酶解濃度對提取天麻多糖和天麻素的影響：分別加入0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.12 g工業(yè)用復(fù)合酶；溫度對提取天麻多糖和天麻素的影響：取備用天麻粉末勻質(zhì)液體加入工業(yè)用復(fù)合酶0.06 g，溫度設(shè)置為35、40、45、50、55、60和66℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)酶解；pH對提取天麻多糖和天麻素的影響：在備用天麻粉末勻質(zhì)液體中分別加入工業(yè)用復(fù)合酶0.06 g，以1 mol/L CH3COOH溶液和1 mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)成pH值分別為4.4、4.6、4.7、4.8、5.0、5.2、5.5和6.0的系列梯度進行實驗。各單因素實驗后測定天麻多糖和天麻素，來確定適合的單因素條件。

2結(jié)果與分析

2.1多糖測定標準曲線的確立［11-12］

在實驗條件下，以標準液濃度（mg/mL）為橫坐標，為吸光度值為縱坐標，得標準曲線，計算回歸方程：y= 5.109 6x+0.007 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，線性良好。

2.2色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.2%磷酸水和30%乙腈（v/v），洗脫：50 min，柱溫60℃，流速：1.0 mL/min；進樣量：25 μL；檢測波長：221 nm。天麻素標準曲線Y=5.6 x-9515.57，R2= 0.999 5，最低檢測限位1.0 μg；制備測定天麻素含量的樣品5份，連續(xù)進樣，測量峰面積值，計算各單糖的RSD（n=5）為0.83%，回收率為95.83%，說明精密度良好。由圖1可知，天麻對照品的保留時間為8.784min，由圖2可知，天麻提取液中含有天麻素，且天麻素提取液中的天麻素保留時間為8.659 min。

2.3影響天麻多糖和天麻素的單因素實驗

不同的酶解溫度對天麻多糖溶出率和天麻素的影響見圖3。

圖1　天麻素標準品色譜Fig.1HPLC of the standard gastrodine

圖2　天麻提取液中天麻素色譜Fig.2HPLC of the gastrodine

圖3　酶解溫度對天麻多糖和天麻素含量的影響Fig.3Effect of enzymolysis temperature on extraction yield of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

圖4　酶解pH對對天麻多糖和天麻素含量的影響Fig.4Effect of enzymolysis pH on extraction yield of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

由結(jié)果分析可知，45℃～55℃天麻多糖和天麻素的提取率之間差異較為明顯，而55℃的天麻多糖和天麻素的提取率最高。因此，溫度選擇在45℃以上，考慮到酶解溫度以及能量節(jié)約宜選擇提取溫度為55℃。

從圖4中可以得出，天麻多糖和天麻素含量隨著溶液的pH的增加呈先增加后減少的趨勢。當(dāng)溶液的pH達到5.0時，兩者含量都達到最大值。當(dāng)溶液的pH超過5.0時，多糖的溶出率和天麻素的含量反而減少，說明這時溶液的pH超過酶的最適pH，活性開始降低，所以最佳pH為5.0。不同酶解濃度對天麻多糖溶出率和天麻素的影響見圖5。

圖5　酶解濃度對天麻多糖和天麻素含量的影響Fig.5Effect of enzymolysis concentration on extraction yield of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

天麻多糖溶出率和天麻素含量隨著復(fù)合酶的增加而增加，天麻多糖在酶解濃度為0.06 g處增加明顯，天麻素含量在0.08 g以前增加明顯，在0.09 g處天麻多糖溶出率和天麻素含量有最大值，此后維持穩(wěn)定。說明此時酶量足夠，已經(jīng)與底物充分作用，因此復(fù)合酶的最佳酶用量為0.09 g。

2.4天麻多糖和天麻素提取工藝條件響應(yīng)面分析試驗結(jié)果

以單因素結(jié)果為依據(jù)，利用Design Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面法試驗，以酶解溫度、酶解濃度和pH為主要考查因素，分別用A、B和C來表示，并以1、0、-1表示自變量的高低水平，以天麻多糖含量與天麻素含量為響應(yīng)值，表現(xiàn)出20個試驗點。因素水平見表1，試驗設(shè)計、二次回歸擬合及方差分析和結(jié)果見表2。

表1　天麻素和天麻多糖提取工藝因素與水平Table 1Factors and levels of Box-behnken design

從回歸分析中可以得出兩者的一次項、二次項均有顯著影響。各實驗因子對響應(yīng)值的影響呈顯著的線性關(guān)系。各實驗因子對天麻素（Y1）和天麻多糖（Y2）的響應(yīng)值的影響分別為：Y1=-741.240 97+8.361 50 A+ 225.559 85 B+219.065 73 C+4.279 17 AB-0.221 62 AC-68.60417BC-0.074445A2-422.92929B2-21.17841C2和Y2=-2 560.057 818+28.803 236 36 A+1 075.321 212 B+761.468 181 8 C+11.983 333 33 AB-0.27AC-191.25BC-0.275 436 364 A2-3 473.232 323 B2-77.397 727 27C2。方差分析結(jié)果由表3和4可知，兩者的模型都P<0.01說明酶解溫度、酶解濃度和pH及其二次項對天麻多糖和天麻素影響極顯著，而交互項均無顯著影響。天麻素和天麻多糖模型決定系數(shù)分別為R2=0.998 0和R2=0.983 2，經(jīng)擬合檢驗，天麻素：P= 0.000 7，天麻多糖：P=0.000 1，差異極顯著，由此說明兩個方程都能很好的反映天麻多糖和天麻素含量與酶解溫度、酶解濃度和pH之間的關(guān)系，而且根據(jù)影響天麻多糖和天麻素提取率大小順序為B：酶解濃度> A：酶解溫度>C：pH。因此，可以應(yīng)用于天麻多糖和天麻素含量提取的理論預(yù)測。依據(jù)據(jù)回歸方程在3個因素的響應(yīng)面圖6～8，相應(yīng)的響應(yīng)面均為凹型曲面，說明天麻素和天麻多糖的含量響應(yīng)值存在著極高值，且響應(yīng)曲面的等高線中心均位于-1～1之間，說明提取的最優(yōu)條件存在于所設(shè)計的因素水平范圍之內(nèi)。通過分析兩者的響應(yīng)面分析結(jié)果可以確定，天麻多糖和天麻素的提取最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶解溫度為54.36℃，酶解濃度為0.09 g和pH為4.73，在此條件下，天麻酶解后天麻素的最高含量為7.281 6 mg/g，天麻多糖的最高含量為38.336 1%。

表2　天麻素和天麻多糖提取工藝條件設(shè)計方案及實驗結(jié)果Table 2Box-behnken design and results of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

表3　天麻素工藝條件響應(yīng)曲面模型分析及方差分析Table 3Response surface and ANVOA analysis of gastrodine

表4　天麻多糖工藝條件響應(yīng)曲面模型分析及方差分析Table 4Response surface and ANVOA analysis of gastrodiae polysaccharides

圖6　酶解溫度和酶解濃度對天麻素和天麻多糖含量的響應(yīng)曲面圖Fig.6Response surface kyrtograph of enzymolysis concentration and enzymolysis temperature on extraction yield of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

圖7　酶解濃度和pH度對天麻素和天麻多糖含量的響應(yīng)曲面圖Fig.7Response surface kyrtograph of enzymolysis concentration and enzymolysis pH on extraction yield of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

圖8　酶解溫度和pH對天麻素和天麻多糖含量的響應(yīng)曲面圖Fig.8Response surface kyrtograph of enzymolysis temperature and enzymolysis pH on extraction yield of gastrodine and gastrodiae polysaccharides

3結(jié)論

通過酶法和響應(yīng)面法聯(lián)用，同時對天麻素和天麻多糖兩種主要活性成分進行提取工藝優(yōu)化研究，兩者的響應(yīng)面分析結(jié)果確定了天麻多糖和天麻素的提取最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶解溫度為54.36℃，酶解濃度為0.09 g和pH為4.73，在此條件下，天麻酶解后天麻素的最高含量為7.281 6 mg/g，天麻多糖的最高含量為38.336 1%。目前提取天麻多糖和天麻素的方法有很多種，包括水浸提法、滲透法、超聲法和酶解法［4，9-11］等。傳統(tǒng)提取方法主要是水提法，操作繁瑣時間長而且提取率相對較低［9-10］。酶解法條件溫和，操作簡單，節(jié)約原材料，有較高的提取率［11］。中藥在其提取過程中會因為一些雜質(zhì)類成分如淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等而影響提取液的質(zhì)量，而適當(dāng)?shù)拿竿ㄟ^溫和的酶解反應(yīng)可將液體中雜質(zhì)出去，從而提高體系澄清度［11］。單獨用復(fù)合酶法提取天麻中天麻素提取率相對較高，但是其耗時較長，而且酶解法中溫度和pH都是影響酶解產(chǎn)物的重要因素，它們不但影響酶的穩(wěn)定性，而且還影響酶的活性中心必需基團的解離狀態(tài)和底物的解離狀態(tài)。在最適pH和溫度范圍內(nèi)，底物才能與酶充分的結(jié)合，產(chǎn)生大量的產(chǎn)物［11］。所以用響應(yīng)面法和酶解法聯(lián)用將天麻中的活性物質(zhì)天麻素和天麻多糖進行提取工藝的優(yōu)化時，將溫度和pH設(shè)計到最佳條件，打破了只是對單一成分進行優(yōu)化設(shè)計，改變了以往提取時天麻資源的嚴重浪費。而且運用改進的HPLC和多糖測定方法對所提取的活性物質(zhì)進行測定，確保了實驗的精度，為天麻活性成分研究提供了方法保證，對天麻的資源開發(fā)和利用具有重要的現(xiàn)實意義。

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Optimization of Enzymolysis Extraction of Gastrodine and Gastrodiae Polysaccharides from Wild Gastrodia elata Blume via Response Surface Methodology

YE Wen-bin
（Department of Life Science and Chemistry，Longnan Teachers College，Chengxian 742500，Gansu，China）

To optimize the technology of enzymolysis and response surface methodology extraction of active material.Used gastrodine and gastrodiae polysaccharides concentration extracted from Wild Gastrodia elata Blume via enzymolysis as experimental assess index，effect of enzymolysis concentration，enzymolysis temperature and pH on gastrodine and gastrodiae polysaccharides extraction were investigated respectively based on single factor variance analysis.Furthermore，its extraction process was optimized based on response surface methodology.In the results that the most optimum enzymolysis extraction processing technology via response surface methodology was as follows：enzyme solution temperature 54.36℃，enzymolysis concentration 0.09 g as well as pH 4.73.The condition of extraction processing technology was easily controlled，simple and lower cost，and the final extraction concentration of gastrodine and gastrodiae polysaccharides was up to 7.281 6 mg/g and 38.336 1%under the processing technology above.

responsesurfacemethodology；enzymolysis；gastrodine；gastrodiaepolysaccharides；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.007

2013-12-05

甘肅省教育廳資助項目（0928B-1）；隴南師范高等?？茖W(xué)校重點項目（2014LSZK01001）

葉文斌（1982—），男（漢），講師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)、果蔬保鮮及植物生理生態(tài)。