遲　濤，張國芳，徐學(xué)博，李　春，武玉婷，劉麗波，*，王辰旭，劉　寧，，*

（1.黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，黑龍江 哈爾濱 150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

葡聚糖修飾米根霉脂肪酶條件優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究

遲濤1，張國芳2，徐學(xué)博2，李春2，武玉婷2，劉麗波2，*，王辰旭2，劉寧1，2，*

（1.黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，黑龍江 哈爾濱 150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

采用經(jīng)高碘酸鈉活化的葡聚糖修飾米根霉脂肪酶，以獲得具有較高酸解催化活性的脂肪酶。研究反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH值、還原劑濃度及葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對化學(xué)修飾效果的影響，并利用Box-Behnken設(shè)計(jì)法及響應(yīng)面優(yōu)化法對米根霉脂肪酶的化學(xué)修飾條件進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)反應(yīng)pH值為7.63、反應(yīng)時(shí)間為15.53 h、還原劑濃度為0.20 mol/L、葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)，脂肪酶酸解率可達(dá)到最高值37.28%。在40 ℃最適溫度條件下，修飾酶的活性是原酶的2.2 倍，且經(jīng)化學(xué)修飾后脂肪酶的穩(wěn)定性有顯著提高。

米根霉脂肪酶；化學(xué)修飾；葡聚糖；響應(yīng)面法；酸解活性

米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase，ROL）是根霉屬的絲狀真菌米根霉產(chǎn)生的一種具有嚴(yán)格1，3位置特異性和對中長鏈底物專一性的脂肪酶［1］。ROL在眾多工業(yè)領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用價(jià)值，有著嶄新而廣闊的發(fā)展前景。但ROL的穩(wěn)定性差，造成酶活性損失嚴(yán)重。目前已有多種方法可用于提高酶的活性及穩(wěn)定性，包括固定化法［2-5］、分子交聯(lián)法［6-7］、蛋白質(zhì)工程法［8-9］及化學(xué)修飾法［10-16］等。其中化學(xué)修飾法以快速、直接和高效的特點(diǎn)獲得了廣泛的應(yīng)用。然而利用現(xiàn)有的技術(shù)對酶進(jìn)行化學(xué)修飾，改變酶活性的過程中，也對酶的穩(wěn)定性造成了很大影響，很難達(dá)到活性和穩(wěn)定性的同步提高［17-18］。葡聚糖作為修飾劑［19-20］，可與酶表面的基團(tuán)反應(yīng)，覆蓋酶表面的大部分，在極性條件下對酶起到一定的保護(hù)作用；同時(shí)，葡聚糖中包含了很多的活性基團(tuán)，能夠很好地改善酶的性能。因此，用葡聚糖修飾ROL會(huì)促進(jìn)其性能提升。

本實(shí)驗(yàn)以ROL為研究對象，利用葡聚糖為修飾劑，首先采用單因素試驗(yàn)篩選影響ROL葡聚糖化學(xué)修飾的主要因素，再通過Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)并進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，建立二次多項(xiàng)回歸模型，對模型進(jìn)行方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，從而得到更精確的工藝條件［21］，最后獲得ROL葡聚糖化學(xué)修飾的最佳參數(shù)，以提高ROL的催化反應(yīng)效率。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

米根霉脂肪酶（ROL），購自美國Sigma公司。

葡聚糖（相對分子質(zhì)量7 萬、20 萬）、聚蔗糖（相對分子質(zhì)量7 萬、40 萬） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；高碘酸鈉、硼氫化鈉、正己烷（色譜純）等 天津市富宇精細(xì)化工公司。

1.2儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用儀器廠；7890A氣相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；旋渦振蕩儀上海精科實(shí)業(yè)有限公司；紫外-可見分光光度計(jì) 美國Beckman公司。

1.3方法

1.3.1葡聚糖的活化［19］

將葡聚糖溶解配制為10 mg/mL的溶液，向溶液中加入高碘酸鈉使其終濃度為50 mmol/L。將上述體系在室溫、黑暗條件下反應(yīng)2 h后再于4 ℃、黑暗條件下反應(yīng)24 h，最后加入500 ?L乙二醇混勻以終止反應(yīng)。1 h后將產(chǎn)物透析處理，得到葡聚糖氧化物，分裝為1 mL于4 ℃冰箱中保存。

1.3.2ROL的化學(xué)修飾及結(jié)構(gòu)表征

稱取20 mg ROL在2 mL pH 6～8的磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4）中溶解。將一定體積的葡聚糖氧化物加入到酶溶液中，混合均勻后在室溫下放置8～48 h后加入不同濃度的硼氫化鈉，不斷攪拌混勻，1 h后將樣品經(jīng)透析處理移去溶劑，再經(jīng)凍干處理即得到經(jīng)葡聚糖修飾的米根霉脂肪酶（dextran-ROL）。取相同濃度的葡聚糖、dextran-ROL和ROL進(jìn)行紫外光譜掃描，以表征ROL經(jīng)修飾后的結(jié)構(gòu)變化。

1.3.3ROL酸解方法［22］

將豬油和辛酸以3∶1（V/V）的比例置于5 mL離心管中，振蕩混勻后放于40 ℃水浴鍋中，再加入底物質(zhì)量5%的脂肪酶催化酸解反應(yīng)，2 h后取出離心管，9 000 r/min離心5 min，吸取上層油相保存于4 ℃冰箱中，待分析。

1.3.4薄層色譜分離酶催化產(chǎn)物［23］

分離條件：硅膠板G，展開劑為石油醚-乙醚-乙酸（80∶20∶2，V/V）。硅膠板G浸入展開劑的深度為距離板底邊0.5～1.0 cm。展開完成后取出硅膠板G，晾干，均勻噴灑0.1% 2，7-二氯熒光素顯色。甘油脂肪酸分離后，各組分的Rf值分別為：固醇0.81、甘三酯0.69、1，3-甘二酯0.31、1，2-甘二酯0.22、甘一酯0.02、脂肪酸0.50。

1.3.5甲酯化方法

將薄層色譜分離得到的甘三酯和甘二酯置于25 mL圓底燒瓶中，加入2 mL 0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液振蕩混勻，在70 ℃水浴中反應(yīng)10 min，取出冷卻后加入即時(shí)配制的BF3-甲醇（1∶3，V/V）溶液3 mL，再于70 ℃水浴回流反應(yīng)5 min，取出冷卻后加入2 mL正己烷充分振蕩，使樣品完全萃取于正己烷中，再加入飽和氯化鈉溶液，靜置5 min后吸取上層正己烷于樣品瓶中保存。

1.3.6氣相色譜測定條件

酶催化產(chǎn)物分析采用安捷倫7890氣相色譜儀和氫火焰離子檢測器。色譜柱：FFAP柱（100 m×0.25 mm，0.20 ?m）；燃?xì)猓篐2，流量30 mL/min；助燃?xì)猓嚎諝?，流?00 mL/min；載氣：He，流量1 mL/min；柱前壓：37.5 MPa；分流比50∶1；進(jìn)樣量1 ?L；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；爐溫：140 ℃，維持5 min；檢測器溫度：2 5 0 ℃。使用安捷倫化學(xué)工作站（HP3398A GC ChemStation）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析，采用面積歸一化法計(jì)算酶催化產(chǎn)物含量。

1.3.7ROL酸解活性的測定

酸解反應(yīng)是在脂肪酶的催化下，甘油三酯與脂肪酸之間發(fā)生?；D(zhuǎn)移從而改變甘油三酯結(jié)構(gòu)組成的反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以豬油和辛酸為底物，通過測定辛酸在甘油三酯上的結(jié)合率（酸解率）來反映脂肪酶的酸解活性，具體計(jì)算公式如下：

1.4葡聚糖對ROL化學(xué)修飾的優(yōu)化

1.4.1單因素試驗(yàn)

采用相對分子質(zhì)量為20萬的葡聚糖作為修飾劑對ROL進(jìn)行化學(xué)修飾，以反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH值、還原劑濃度、葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為主要影響因素，在反應(yīng)時(shí)間8～48 h、反應(yīng)pH 6～8、還原劑濃度0.05～0.40 mol/L和葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%～0.6%條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對酶修飾效果的影響。

1.4.2響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四因素三水平共計(jì)29 組試驗(yàn)。以反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH值、還原劑濃度和葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為自變量，酸解率為響應(yīng)值建立二次多項(xiàng)式回歸模型，得到最優(yōu)組合水平，確定葡聚糖化學(xué)修飾ROL的最佳條件，并進(jìn)行最佳工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1ROL修飾劑的選擇

酶的催化功能本質(zhì)上是由其特定的空間結(jié)構(gòu)，特別是活性中心的特定構(gòu)象所決定的，水溶性大分子與酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)通過共價(jià)鍵結(jié)合后，可使酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，使酶活性中心更有利于底物結(jié)合，并形成準(zhǔn)確的催化部位，從而使酶活性提高。

選擇適合的修飾劑，利用化學(xué)修飾的方法改變脂肪酶的性能是提高脂肪酶催化活性是高效手段。由于ROL的穩(wěn)定性較差，在提高其活性的同時(shí)保持或提高其穩(wěn)定性也尤為重要。選擇大分子多糖對ROL進(jìn)行修飾，不僅可以提高其催化活性，而且多糖通過與酶表面的氨基共價(jià)結(jié)合，對酶分子進(jìn)行修飾，在酶分子外圍形成保護(hù)層，在極端條件下對酶分子可起到一定的保護(hù)作用，對酶穩(wěn)定性的提高有很好的效果。本實(shí)驗(yàn)中選擇不同相對分子質(zhì)量的水溶性多糖（葡聚糖、聚蔗糖、菊糖）作為修飾劑，對比修飾后ROL催化酸解反應(yīng)活性的高低，判斷修飾效果。

圖1　不同多糖修飾對ROL酸解活性影響Fig.1　Effect of modification with different polysaccharides on the activity of Rhizopus oryzae lipase

由圖1可知，相對分子質(zhì)量20萬的葡聚糖（A3）修飾的ROL酸解率最高，是原酶（A0）酸解率的1.5 倍。相對分子質(zhì)量2萬的葡聚糖（A2）修飾的ROL酸解率高于相對分子質(zhì)量7萬的聚蔗糖（A1）修飾的ROL，A3修飾的ROL酸解率高于相對分子質(zhì)量40萬的聚蔗糖（A4）修飾的ROL，說明相對分子質(zhì)量的相近的多糖，葡聚糖對ROL的修飾效果優(yōu)于聚蔗糖；而A3的酸解率高于A2，A4的酸解率高于A1，可見同種多糖，相對分子質(zhì)量大越大，其所修飾的ROL酸解率越高，即修飾效果越好。綜合以上結(jié)果，選擇相對分子質(zhì)量20萬的葡聚糖作為修飾劑進(jìn)行修飾條件的具體優(yōu)化。

2.2產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

圖2　葡聚糖、ROL和dextran-ROL紫外吸收光譜Fig.2　UV absorption spectra of dextran， ROL and dextran-ROL

由圖2可知，經(jīng)過化學(xué)修飾后，dextran-ROL在200～230 nm波長范圍內(nèi)最大吸收峰的吸光度增大，最大吸收波長也有偏移。ROL經(jīng)修飾后，在280 nm波長附近的特征吸收峰值明顯減弱，這是因?yàn)槠暇厶茄趸笊傻娜┗膳cROL表面的氨基反應(yīng)，使酶與葡聚糖連接到一起，從而對酶蛋白表面的色氨酸和酪氨酸等基團(tuán)（在280 nm波長處有特征吸收峰）造成影響，影響酶蛋白的結(jié)構(gòu)。因此該峰的變化反映了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，證明了葡聚糖與酶蛋白結(jié)合，使酶蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

2.3葡聚糖修飾ROL的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1反應(yīng)時(shí)間對修飾酶dextran-ROL活性的影響

當(dāng)反應(yīng)pH值為7.5、還原劑濃度為0.2 mol/L、葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，考察反應(yīng)時(shí)間對修飾酶活性的影響，結(jié)果見圖3。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，葡聚糖與酶充分接觸，反應(yīng)完全。但反應(yīng)時(shí)間也不是越長越好，活化后的葡聚糖不夠穩(wěn)定，可能會(huì)因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間過長而使葡聚糖失去活性。由圖3可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于16 h時(shí)，酶活性隨時(shí)間的延長而升高，在16 h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，而后又隨反應(yīng)時(shí)間的延長降低。因此在后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間的中心值選擇為16 h。

圖3　反應(yīng)時(shí)間對修飾酶活性的影響Fig.3　Effect of reaction time on the activity of modified ROL

2.3.2反應(yīng)pH值對修飾酶dextran-ROL活性的影響

當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為20 h、還原劑濃度為0.2 mol/L、葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，考察反應(yīng)pH值對修飾酶活性的影響，結(jié)果見圖4。pH值的變化能夠改變肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)的電荷，從而引起肽鏈構(gòu)象的變化。同理，pH值也會(huì)對酶蛋白表面基團(tuán)的電荷產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響基團(tuán)與修飾劑的結(jié)合，從而影響修飾效果。由圖4可知，ROL在酸性條件下被修飾后活性較低，隨著pH值的升高，dextran-ROL的活性有顯著提高，在pH 7.6時(shí)達(dá)到最高，隨后又快速降低。因此在后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)pH值的中心值選為7.6。

圖4　反應(yīng)pH值對修飾酶活性的影響Fig.4　Effect of pH on the activity of modified ROL

2.3.3還原劑濃度對修飾酶dextran-ROL活性的影響

當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為20 h、反應(yīng)pH值為7.5、葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，考察還原劑濃度對修飾酶活性的影響，結(jié)果見圖5。還原劑硼氫化鈉的作用是使酶與葡聚糖反應(yīng)形成的不穩(wěn)定雙鍵還原為高穩(wěn)定性的單鍵，所以還原劑的添加量對產(chǎn)物穩(wěn)定性會(huì)產(chǎn)生一定影響。由圖5可知，dextran-ROL的活性隨還原劑濃度的增加先升高后緩慢降低，在還原劑濃度為0.2 mol/L時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。因此在后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，還原劑濃度的中心值選擇為0.2 mol/L。

圖5　還原劑濃度對修飾酶活性的影響Fig.5　Effect of reductant concentration on the activity of modified ROL

2.3.4葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對修飾酶dextran-ROL活性的影響

圖6　葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對修飾酶活性的影響Fig.6　Effect of dextran concentration on the activity of modified ROL

當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為20 h、反應(yīng)pH值為7.5、還原劑濃度為0.2 mol/L時(shí)，考察葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對修飾酶活性的影響，結(jié)果見圖6。葡聚糖的用量對修飾效果也會(huì)產(chǎn)生一定的影響，當(dāng)葡聚糖用量太少時(shí)，酶分子的基團(tuán)未能被完全修飾；葡聚糖用量過多則會(huì)造成資源的浪費(fèi)。由圖6可知，dextran-ROL的活性隨著葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先升高后降低，在葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。因此在后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)中，葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的中心值選擇為0.3%。

2.4響應(yīng)面法優(yōu)化葡聚糖修飾ROL結(jié)果分析

2.4.1試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理［24］，進(jìn)行29 組響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表1。

表1　葡聚糖修飾ROL的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table1　Box-Behnken experimental design with experimental results for dextran-modified ROL

對表1中的數(shù)據(jù)利用Design Expert 7.0.0軟件分析，獲得酸解率（Y）對反應(yīng)pH值（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、還原劑濃度（C）和葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（D）的二次多項(xiàng)回歸模型：

Y=36.96+2.16A-2.57B+0.067C-1.42D-2.78AB+ 10.07AC+0.60AD+1.24BC-0.29BD+1.56CD-11.25A2-12.25B2-12.09C2-15.72D2（2）

對模型進(jìn)行方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。二次多項(xiàng)式模型極顯著（P＜0.01，R2=0.991 7）；失擬項(xiàng)不顯著（P=0.051 8＞0.05）。一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AC和二次項(xiàng)的影響均極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)D、交互項(xiàng)AB和CD的影響顯著（P＜0.05）；其他項(xiàng)均為不顯著。由F值檢驗(yàn)可知，4 個(gè)因素對酸解率影響作用的大小依次為B＞A＞D＞C，說明反應(yīng)時(shí)間對ROL酸解活性的影響最大，其次是反應(yīng)pH值和葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，還原劑濃度對修飾酶的活性影響最弱。

表2　回歸模型方程方差分析Table2　Analysis of variance （ANOVA） for response surface quadratic model

2.4.2響應(yīng)面優(yōu)化與分析

響應(yīng)面三維空間曲線圖是不同因素對響應(yīng)值影響強(qiáng)弱的立體直觀反映，當(dāng)曲線面陡峭時(shí)，表明因素對響應(yīng)值影響較大；當(dāng)曲線面平緩時(shí)，表明因素對響應(yīng)值影響較小。二維等高線是兩種因素交互作用的結(jié)果，通過其形狀可以判斷出各因素交互作用的大小，橢圓形表示兩因素交互作用對響應(yīng)值影響顯著，圓形則說明兩因素的交互作用不顯著［25］。

基于二次回歸模型繪制各因素間交互作用 的響應(yīng)面圖，如圖7所示。

圖7　不同因素影響修飾酶酸解活性的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface plots for the effects of different factors on the activity of modified lipase

圖7a為反應(yīng)pH值和反應(yīng)時(shí)間對修飾酶酸解活性影響的響應(yīng)曲面圖，圖中等高線呈橢圓形，表明反應(yīng)pH值和反應(yīng)時(shí)間的交互作用顯著。響應(yīng)曲面陡峭，表明反應(yīng)pH值和反應(yīng)時(shí)間對修飾酶酸解活性的影響均為顯著（P＜0.05）。當(dāng)還原劑濃度和葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定在0水平上，反應(yīng)時(shí)間不變時(shí)，隨著反應(yīng)pH值的變化，修飾酶酸解活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)反應(yīng)pH值在7.6附近時(shí)，修飾酶酸解活性達(dá)到最大；當(dāng)反應(yīng)pH值不變時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，修飾酶酸解活性在反應(yīng)時(shí)間為16 h左右達(dá)到最大值。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件范圍內(nèi)，二者交互作用表現(xiàn)為修飾酶酸解活性的增大。

圖7b為反應(yīng)pH值和還原劑濃度對修飾酶酸解活性影響的響應(yīng)曲面圖，圖中響應(yīng)曲面的坡度較為陡峭，表明反應(yīng)pH值和還原劑濃度兩個(gè)因素對修飾酶酸解活性的影響均較大，等高線呈明顯的橢圓形，表明二者的交互作用極顯著。

圖7c為反應(yīng)時(shí)間和葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對修飾酶酸解活性影響的曲面圖，當(dāng)還原劑濃度和反應(yīng)pH值固定在0水平上，葡聚糖濃度不變時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，修飾酶酸解率先升高后降低；在反應(yīng)時(shí)間保持不變時(shí)，隨著葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，修飾酶酸解活性也呈現(xiàn)先升高后降低。所以，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在14～18 h之間，葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.25%～0.35%之間時(shí)，修飾酶的酸解活性達(dá)到最高值。且二者的交互作用表現(xiàn)為修飾酶酸解活性增大，但等高線形狀近圓形，表明兩因素交互作用對修飾酶酸解活性的影響不夠顯著。

基于以上分析，進(jìn)一步通過軟件分析計(jì)算，得到修飾酶酸解活性達(dá)到最大值時(shí)的各因素水平為：反應(yīng)pH 7.63、反應(yīng)時(shí)間15.53 h、還原劑濃度0.20 mol/L、葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%，此時(shí)修飾酶的酸解率預(yù)測值為37.28%。

2.4.3最佳工藝條件的驗(yàn)證結(jié)果

為了驗(yàn)證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，在反應(yīng)pH 7.63、反應(yīng)時(shí)間15.53 h、還原劑濃度0.20 mol/L、葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的條件下重復(fù)進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，得到酸解率分別為37.80%、36.07%和38.83%，平均值為37.57%，相對誤差為0.77%，與優(yōu)化模型分析中所得到的理論值基本一致，證明此模型合理有效。因此采用響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確，是可靠的實(shí)用依據(jù)。

2.5ROL和dextran-ROL酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1酶的最適反應(yīng)溫度

在反應(yīng)溫度為35、40、45、50、55、60 ℃條件下，以豬油和辛酸為底物，測定ROL及dextran-ROL的酸解活性，得到兩種酶的最適反應(yīng)溫度。

圖8　原酶與修飾酶的最適反應(yīng)溫度Fig.8　Optimum temperatures for ROL and dextran-ROL

由圖8可知，ROL和dextran-ROL酸解活性隨溫度的變化趨勢基本一致，隨著反應(yīng)溫度的升高，ROL及dextran-ROL的酸解率先升高后降低，都在40 ℃時(shí)達(dá)到最大值，因此ROL和dextran-ROL的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，此時(shí)dextran-ROL的酸解活性是ROL的2.2 倍，且ROL在55 ℃已經(jīng)幾乎失去活性，而dextran-ROL在60 ℃時(shí)仍具有一定的活性，所以dextran-ROL有一定耐高溫能力。溫度對酶催化活性的影響表現(xiàn)在適當(dāng)升高溫度可以提高催化反應(yīng)速率，在相同時(shí)間內(nèi)可獲得更多的產(chǎn)物，但是當(dāng)溫度過高時(shí)會(huì)使酶蛋白發(fā)生變性而失去活性。

2.5.2酶的熱穩(wěn)定性

將ROL和dextran-ROL溶液分別于在45、50、55、60、65℃水浴中保溫30 min后，測定酶的酸解活性，定義酶活性最高一組的相對酶活力為100%。

由圖9可知，dextran-ROL在40～45 ℃之間的熱穩(wěn)定性較好，保溫30 min后，相對酶活力仍能保持在98%以上，之后隨著溫度的升高緩慢下降，在65 ℃保溫30 min后，相對酶活力剩余不到5%，酶幾乎已經(jīng)失去全部活性。ROL的穩(wěn)定性較差，隨著溫度的升高，相對酶活力大幅度下降。

圖9　反應(yīng)溫度對原酶與修飾酶穩(wěn)定性的影響Fig.9　Effect of temperature on the stability of the native and modified enzyme

2.5.3酶的pH值穩(wěn)定性

將酶溶于不同pH 4～9的磷酸鹽緩沖液中，于4 ℃冰箱中保存1 h后，對酶的酸解活性進(jìn)行測定。定義酶活性最高一組的相對酶活力為100%。

圖10　pH值對原酶與修飾酶穩(wěn)定性的影響Fig.10　Effect of pH on the stability of the native and modified enzyme

由圖10可知，dextran-ROL和ROL在中性溶液中保存后對其活性影響較小，仍能保持較高活力。dextran-ROL比ROL的耐酸耐堿性明顯提高，在pH 6的弱酸性溶液中保存后，dextran-ROL仍保留了95%以上的相對酶活力，而ROL僅剩余90%；在弱堿性條件下（pH 8），dextran-ROL保留活力高于ROL 20%，且在pH 9時(shí)，ROL幾乎失活，而dextran-ROL仍保留50%以上的相對酶活力。

經(jīng)過化學(xué)修飾，ROL的穩(wěn)定性有顯著性的提高，主要有以下兩個(gè)可能的原因：1）葡聚糖與酶蛋白分子表面的共價(jià)連接減弱了酶分子內(nèi)部的熱振動(dòng)，使酶不易延展失活，即分子構(gòu)象變得“剛性”，從而提高了酶的熱穩(wěn)定性［26］。2）葡聚糖與酶表面的多位點(diǎn)交聯(lián)，有效地提高了酶結(jié)構(gòu)的整體穩(wěn)定性，葡聚糖上的眾多羥基有效地維持了酶表面的親水性微環(huán)境［27］。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用葡聚糖為修飾劑，采用化學(xué)修飾的方法，使ROL的酸解活性提高。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對修飾條件進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)反應(yīng)pH值為7.63、反應(yīng)時(shí)間為15.53 h、還原劑濃度為0.20 mol/L、葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)，dextran-ROL的酸解率達(dá)到最高值37.28%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測分析值基本相符。

通過響應(yīng)面試驗(yàn)分析可知，各因素對修飾酶活性的影響大小依次為：反應(yīng)時(shí)間＞反應(yīng)pH值＞葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞還原劑濃度。且反應(yīng)pH值與還原劑濃度、反應(yīng)pH值與反應(yīng)時(shí)間、還原劑濃度與葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用對修飾酶酸解活性影響顯著。

實(shí)驗(yàn)還確定了dextran-ROL的最適反應(yīng)溫度為40 ℃。在最適反應(yīng)溫度下，dextran-ROL的酸解活性是ROL的2.2 倍。葡聚糖修飾使ROL的熱穩(wěn)定性及pH值穩(wěn)定性均有了明顯提高。

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Optimization of Rhizopus oryzae Lipase Modified with Dextran and Its Stability

CHI Tao1， ZHANG Guofang2， XU Xuebo2， LI Chun2， WU Yuting2， LIU Libo2，*， WANG Chenxu2， LIU Ning1，2，*
（1. Heilongjiang Dairy Industry Technical Development Center， Harbin 150028， China；2. Key Laboratory of Dairy Science， Ministry of Education， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China）

In order to obtain a high activity of acidolysis， Rhizopus oryzae lipase （ROL） was modified with NaIO4-oxidized dextran. The effects of reaction time， reaction pH， reductant concentration and dextran concentration on modification efficiency were studied. Box-Behnken experimental design and response surface methodology were used to optimize the modification conditions as follows： pH 7.63； reaction time， 15.53 h； reductant concentration， 0.20 mol/L； and dextran concentration， 0.3%. Under these conditions， the maximum predicted acidolysis rate of lipase of 37.28% was obtained， which was basically consistent with the experimental value. The effect of the above four factors on the acidolysis rate of lipase was in the decreasing order of reaction time， reaction pH， dextran concentration and reductant concentration. After chemical mod ification， ROL had obvious changes in absorption characteristics in the ultraviolet region. The maximum absorption wavelength was obviously different. At the optimum temperature of 40 ℃， the activity of dextran-ROL was increased 2.2 times compared to ROL， and the stability of dextran-ROL was also improved significantly.

Rhizopus oryzae lipase； chemical modification； dextran； response surface methodology； acid hydrolysis activity

TS252.54

A

1002-6630（2015）13-0107-07

10.7506/spkx1002-6630-201513021

2015-01-19

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD09B0304）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301519；31201397）；黑龍江省科技廳面上項(xiàng)目（C201134）

遲濤（1979—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：ctlovegirl@sina.com

劉麗波（1979—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：liboliu@126.com劉寧（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠窢I養(yǎng)。E-mail：ningliu66@126.com