張　雯，劉　康，羅霏霏，張敏娟，李彥軍

（陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西 西安 710021）

響應面法優(yōu)化木醋桿菌發(fā)酵釀酒丟糟水解液產(chǎn)細菌纖維素培養(yǎng)基及其產(chǎn) 物性能

張雯，劉康，羅霏霏，張敏娟，李彥軍

（陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西 西安 710021）

為提高木醋桿菌（Acetobacter xylinum）發(fā)酵釀酒丟糟水解液生產(chǎn)細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）的產(chǎn)量，采用響應面法對發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，同時比較了發(fā)酵產(chǎn)物BC的性能和結構。通過單因素及響應面試驗結果確定木醋桿菌發(fā)酵釀酒丟糟水解液生產(chǎn)BC的最佳培養(yǎng)基配方為：蔗糖39.33 g、蛋白胨20.01 g、MgSO40.91 g、檸檬酸鈉3.45 g、黃嘌呤1.02 g、乙醇10 mL、酒糟水解液1 000 mL、pH 6.0。在此條件下BC的產(chǎn)量為6.27 g/L，較優(yōu)化前（4.4 g/L）提高了42.5%。利用傅里葉紅外光譜、X射線衍射、掃描電子顯微鏡對發(fā)酵產(chǎn)物BC的性能和結構進行了比較，結果表明，酒糟水解液發(fā)酵產(chǎn)物BC結構性能與基本培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物BC的基本一致，說明酒糟水解液能夠替代部分發(fā)酵原料發(fā)酵生產(chǎn)BC，且不影響B(tài)C性能。

釀酒丟糟；細菌纖維素；培養(yǎng)基優(yōu)化；響應面法；性能

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是由生長在液態(tài)含糖基質(zhì)中的革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的纖維素成分。與植物纖維素相比，BC不含半纖維素和木質(zhì)素，具有高持水率（大于90%）、高分子質(zhì)量以及較高的結晶度。目前，BC作為一種新型功能材料受到了科學界的廣泛關注，如今已成功地應用于食品、生物醫(yī)學、造紙、聲學器材、化妝品、膜濾器等多個領域［1-2］。但BC培養(yǎng)基成本高、產(chǎn)量低等問題卻是其工業(yè)化生產(chǎn)和推廣應用的瓶頸。利用各種廢渣、廢液進行生產(chǎn)，減輕環(huán)保壓力，其應用前景比動植物多糖更為廣闊［3］。

我國是白酒生產(chǎn)和消費的大國，在釀制白酒的過程中不可避免地會出現(xiàn)釀酒副產(chǎn)物酒糟、黃水、酒尾等。通常每生產(chǎn)1 t白酒就要產(chǎn)生3 t酒糟，2008年我國白酒的產(chǎn)量約為600 萬t，這樣我國每年酒糟的產(chǎn)量就達1 800多萬噸。一方面由于對其開發(fā)利用有限易造成污染環(huán)境，而另一方面酒糟中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，又造成資源的浪費。閻立平等［4］曾研究了用米酒糟制備BC，沈金 朋等［5］利用未經(jīng)預處理的酒糟為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)BC，發(fā)酵15 d后的BC產(chǎn)量為2.7 g/L。本研究擬利用白酒酒糟水解液作為發(fā)酵原料，采用響應面法對BC發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。同時利用傅里葉紅外光譜（fourier transform infrared，F(xiàn)T-IR）、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）研究發(fā)酵產(chǎn)物BC性能及結構，探索酒糟作為發(fā)酵原料對BC的影響。本研究可為BC發(fā)酵提供一種廉價原料，為其規(guī)?；a(chǎn)提供技術依據(jù)，同時可為酒糟的綜合利用、附加值的提升和酒類的清潔化生產(chǎn)提供一條新的途徑，具有良好的社會效益及經(jīng)濟效益。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

木醋桿菌（Acetobacter xylinum） 陜西科技大學制藥工程實驗室；酒糟 西安酒廠；纖維素酶（700 EGU/g）、淀粉酶（135 KNU/g）、糖化酶（170 AGU/g）、堿性蛋白酶（2.4 AU/g） 諾維信（中國）生物技術有限公司。

固體培養(yǎng)基：蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、Na2HPO44.40 g、檸檬酸0.80 g、瓊脂18.00 g、乙醇10 mL、自來水1 000 mL，pH 6.0；種子培養(yǎng)基：蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、Na2HPO44.40 g、檸檬酸0.80 g、乙醇10 mL、自來水1 000 mL，pH 6.0；基本發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、乙醇10 mL、酒糟水解液1 000 mL，pH 6.0；其余試劑均采用國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2儀器與設備

S-4800電鏡掃描儀 日本日立公司；D/max2200PC全自動X射線衍射儀 日本Rigaku公司；VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國Brucher公司；MG250B恒溫培養(yǎng)箱、HYG-1A恒溫振蕩器 上海新瑞儀器有限公司；XPS-8CA光學顯微鏡 上海光學儀器有限公司；752型紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1還原糖含量的測定

采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法［6］測定。

1.3.2氨基態(tài)氮含量的測定

采用凱氏定氮法［7］測定。

1.3.3BC膜處理

將發(fā)酵所得BC膜浸泡于0.10 mol/L NaOH溶液中，80 ℃浸泡30 min，繼續(xù)加熱煮沸2 h，再用蒸餾水反 復沖洗，直到pH值為7.0，冷凍干燥［8-9］。

1.3.4BC膜產(chǎn)量測定

采用稱質(zhì)量法［10］測定。

1.3.5BC鑒定及基團分析

采用傅里葉紅外光譜掃描法［9］。樣品處理：取適量BC干膜放入紅外光譜儀中進行測定，450 mW，掃描范圍4 500～400 cm-1，設定分辨率4 cm-1，掃描速率為0.2 cm/s，室溫下操作。

1.3.6BC膜結晶度

采用X射線衍射光譜掃描法［9］。樣品處理：BC干膜平整固定在樣品架上，銅靶，測試電壓40 kV，測試電流100 mA，速率5°/min，步寬0.02°，2θ為0～80°范圍掃描。根據(jù)X衍射參數(shù)，由下面兩個計算公式分別計算細菌纖維素的結晶度（Xc）和晶體的粒徑（L）。

式中：I為衍射峰的衍射強度；Iam為無定形區(qū)衍射強度；L為晶體的粒徑/nm；β為半峰寬/rad；k為常數(shù)，通常取0.89；λ為X射線波長（0.154 06 nm）；θ為布拉格衍射角/（°）。

1.3.7BC膜表面形貌

采用掃描電鏡法［9］。樣品處理：處理后的BC干膜置于液氮中，脆斷處理，分別取斷面及表面制樣，噴金鍍膜后利用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結構，電壓25 kV。

1.4酒糟水解液的制備

取經(jīng)粉碎干燥的酒糟，加自來水至液固比為10∶1（V/m），加纖維素酶至終濃度為25.00 EGU/g，pH 5.0～6.0、60 ℃條件下水解6 h，反應結束后升溫至100 ℃，維持10 min滅酶，得水解液1。水解液1加淀粉酶至終濃度為25.00 KNU/g，pH 5.5～6.5、70 ℃水解60 min，反應結束后升溫至100 ℃，維持10 min滅酶，得水解液2。水解液2加糖化酶至終濃度為15.00 AGU/g，pH 4.0～5.0、70 ℃水解40 h，反應結束后升溫至100 ℃，維持10 min滅酶，得水解液3。水解液3加堿性蛋白酶至終濃度為0.10 AU/g，pH 8.0～9.0、70 ℃水解10 h，反應結束后升溫至100 ℃，維持10 min滅酶，得酒糟水解液。

1.5BC的發(fā)酵

斜面培養(yǎng)：挑取木醋桿菌保藏菌種劃斜面，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d；種子液制備：挑取木醋桿菌活化菌種接種子培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，培養(yǎng)液置于30 ℃，160 r/min搖床振蕩30 min，得種子液；發(fā)酵培養(yǎng)：移取木醋桿菌種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量30 mL/250 mL三角瓶，接種量20%，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)10 d。

1.6單因素試驗

以發(fā)酵液中BC產(chǎn)量為指標，考察碳源種類及含量（葡萄糖、蔗糖、乳糖，設計質(zhì)量濃度20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00、80.00 g/L）、氮源種類及含量（酵母膏、牛肉膏、蛋白胨，設計質(zhì)量濃度10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00 g/L）、無機鹽種類及含量（MgSO4、Na2HPO4、檸檬酸鈉，設計質(zhì)量濃度1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 g/L）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）抑制劑種類及含量（黃嘌呤、咖啡因，設計質(zhì)量濃度0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10、1.50、2.00 g/L）等因素對BC產(chǎn)量的影響。初始培養(yǎng)基配方為：蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、乙醇10 mL、酒糟水解液1 000 mL、pH 6.0，后續(xù)因素的試驗將前一個因素的較佳條件帶入以置換初始條件。

1.7響應面試驗設計

在單因素試驗結果基礎上，采用Design Expert 7.0軟件，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，選取影響較大的因素，以發(fā)酵液中BC產(chǎn)量為響應值設計試驗。

1.8發(fā)酵產(chǎn)物性能研究

以木醋桿菌（Acetobacter xylinum）為菌種，按照優(yōu)化培養(yǎng)基配方制備酒糟水解液發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)BC，記為BC-YP，利用基本培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)BC記為BC-DZ。利用FT-IR、SEM、XRD對BC-YP及BC-DZ進行檢測，研究酒糟水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)基原料對BC性能的影響。

1.9數(shù)據(jù)處理方法

所有數(shù)據(jù)均用3 次平行實驗的平均值表示，用SPSS 18軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1碳源對BC產(chǎn)量的影響

圖1　碳源種類及質(zhì)量濃度對BC產(chǎn)量的影響Fig.1　Effect of carbon source type and mass concentration on the yield of BC

由圖1可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中所加入葡萄糖質(zhì)量濃度低于30.00 g/L，蔗糖和乳糖質(zhì)量濃度低于40.00 g/L時，BC產(chǎn)量隨著糖質(zhì)量濃度的增大呈上升趨勢。隨著所添加糖質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，BC產(chǎn)量反而降低。相同質(zhì)量濃度水平下，蔗糖作為碳源時BC產(chǎn)量最大，其次分別是乳糖、葡萄糖。分析原因，主要有以下四方面：1）培養(yǎng)基中糖含量過低，所提供碳源不能滿足菌體細胞的生長及產(chǎn)物的合成，因此BC產(chǎn)量較低；2）培養(yǎng)基中糖含量過高，引起培養(yǎng)基滲透壓過高，抑制菌體細胞的生長及產(chǎn)物的合成，使BC產(chǎn)量降低；3）相較于蔗糖和乳糖，葡萄糖為微生物可更快速利用的碳源。高質(zhì)量濃度葡萄糖的快速利用，容易引起糖代謝途徑中丙酮酸的積累及無氧酵解產(chǎn)物乳酸、醋酸等的產(chǎn)生，使發(fā)酵液pH值降低，不利于細胞的生長及產(chǎn)物的合成［11］。同時快速利用基質(zhì)的利用易產(chǎn)生對產(chǎn)物合成相關酶的阻遏作用，不利于發(fā)酵過程由細胞生長期轉(zhuǎn)為產(chǎn)物生產(chǎn)期，從而降低產(chǎn)物產(chǎn)量；4）蔗糖和乳糖作為碳源時，微生物對其水解速率不同，其利用速率也不相同。培養(yǎng)基中添加40.00 g/L的蔗糖比相同質(zhì)量濃度的乳糖發(fā)酵產(chǎn)BC產(chǎn)量高，可能是因為木醋桿菌（Acetobacter xylinum）在代謝過程中將蔗糖水解為葡萄糖及果糖，其代謝及利用速率更適宜于產(chǎn)物BC的合成，因而可促進BC的合成。因此選擇蔗糖質(zhì)量濃度40.00 g/L為較佳參數(shù)。

2.1.2氮源對BC產(chǎn)量的影響

圖2　氮源種類及質(zhì)量濃度對BC產(chǎn)量的影響Fig.2　Effect of nitrogen source type and mass concentration on the yield of BC

由圖2可知，發(fā)酵培養(yǎng)中分別加入牛肉膏、酵母膏、蛋白胨作為氮源時，隨著氮源質(zhì)量濃度的升高，BC產(chǎn)量呈先上升再下降的趨勢，其最大產(chǎn)量對應氮源質(zhì)量濃度均為20.00 g/L。表明酒糟水解液中的蛋白質(zhì)不能滿足BC發(fā)酵所需氮源，需要外源添加氮源，最適添加量20.00 g/L。外源添加量繼續(xù)增加時，發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的質(zhì)量濃度過高，易引起菌體細胞生長速率過快，不利于發(fā)酵過程由細胞生長期轉(zhuǎn)為產(chǎn)物生產(chǎn)期，從而降低BC產(chǎn)量。所添加3 種氮源中，蛋白胨作為氮源時，BC產(chǎn)量最高，可達4.75 g/L，表明蛋白胨為木醋桿菌發(fā)酵生產(chǎn)BC最佳氮源。因此選擇蛋白胨質(zhì)量濃度20.00 g/L為較佳參數(shù)。

2.1.3無機鹽對BC產(chǎn)量的影響

圖3　無機鹽種類及質(zhì)量濃度對BC產(chǎn)量的影響Fig.3　Effect of inorganic salt type and mass concentration on the yield of BC

由圖3可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為3.50 g/L時，BC產(chǎn)量最高。根據(jù)Zeng Xiaobo［11］、Chen Lin［12］等的研究結果，發(fā)酵過程中，糖的利用引起的pH值降低會抑制BC的合成，因此培養(yǎng)基中添加具有pH值緩沖能力的基質(zhì)，能夠提高BC的產(chǎn)量。本試驗中，微生物代謝檸檬酸鈉時生成堿性產(chǎn)物，能夠起到上述作用，試驗結果與文獻［11］報道一致。圖3表明，培養(yǎng)基中MgSO4質(zhì)量濃度為1.00 g/L時，BC產(chǎn)量最高，這與Son等［13］的研究結果一致。Mg2+是微生物代謝過程中多種酶的輔基，如大部分核酸復制轉(zhuǎn)錄相關酶均需Mg2+保證其催化活性，因此，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加合適質(zhì)量濃度的Mg2+，對BC的合成具有促進作用。同時，發(fā)酵培養(yǎng)基中Na2HPO4的加入并沒有對BC的合成表現(xiàn)出促進作用，BC產(chǎn)量反而有所降低，分析原因，可能是培養(yǎng)基中過量的磷酸鹽對糖代謝過程中戊糖磷酸途徑產(chǎn)生了抑制作用，從而抑制BC的合成。因此培養(yǎng)基中無機鹽選擇檸檬酸鈉和MgSO4進行進一步研究。

2.1.4PDE抑制劑對BC產(chǎn)量的影響

圖4　PDE酶抑制劑對BC產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of PDE inhibitors on the yield of BC

由圖4可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中黃嘌呤和咖啡因的加入對BC的合成具有明顯的促進作用，添加黃嘌呤質(zhì)量濃度為1.10 g/L，咖啡因質(zhì)量濃度為0.90 g/L時，BC產(chǎn)量可分別提高17.7%、7.0%。BC生物合成過程如圖5所示，纖維素合成酶在環(huán)鳥苷酸（C-di-GMP）的激活下能夠保持較高活性，C-di-GMP又能被PDE水解為無活性的線狀鳥苷酸，因此理論上PDE抑制劑能夠促進BC的合成。咖啡因、黃嘌呤和茶堿等可抑制PDE的活性［14］，使C-di-GMP在細胞內(nèi)保持較高水平，提高纖維素合成酶活性，從而提高BC的合成速率。試驗結果與理論分析一致。同時結果表明，黃嘌呤對BC合成的促進作用優(yōu)于咖啡因，因此培養(yǎng)基中PDE抑制劑選擇黃嘌呤進行進一步研究。

圖5　BC生化合成過程Fig.5　Biochemical synthesis process of BC

2.2響應面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方

2.2.1響應面試驗設計及結果

綜合單因素試驗結果，進一步對蔗糖、蛋白胨、檸檬酸鈉、MgSO4及黃嘌呤質(zhì)量濃度5 個因素進行優(yōu)化。以這5 個因素為自變量，以BC產(chǎn)量為響應值，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，設計中心組合試驗。試驗設計方案及結果見表1。

表1　Box-Behnken試驗設計與結果Table1　Box-Behnken experimental design and results

續(xù)表1

利用Design Expert 7.0軟件，以蔗糖、蛋白胨、檸檬酸鈉、MgSO4及黃嘌呤質(zhì)量濃度為響應變量，以BC產(chǎn)量為響應值對表1數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得到回歸模型方程為：Y=6.29-0.13A+0.052B-0.20C-0.15D-0.19E+0.11AB+0.086AC-3.75×10-3AD-0.015AE-0.036BC-0.015BD+0.54BE+0.18CD+0.24CE-0.033DE-1.07A2-1.12B2-0.64C2-0.91D2-1.23E2。

表2　回歸方程方差分析結果Table2　Analysis of variance for the developed regression equationTable2　Analysis of variance for the developed regression equation

回歸方程的方差分析結果見表2?；貧w模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P = 0.77＞0.05），表明回歸方程擬合程度良好；決定系數(shù)R2= 0.948 5，說明因變量與考察的自變量之間的線性關系顯著；模型校正決定系數(shù)即該模型能解釋響應值變化的90.72%，均說明模型可信度較高。，說明該模型預測性良好；一次項A、D對BC產(chǎn)量影響是顯著的，C、E對BC產(chǎn)量影響是極顯著的，二次項A2、B2、C2、D2、E2及交互相BE對BC產(chǎn)量影響是極顯著的，說明各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系；由F值判斷，在選擇范圍內(nèi)，5 個因素對BC產(chǎn)量的影響順序為C＞E＞D＞A＞B。綜上所述，使用該模型可以較好地對響應值（BC產(chǎn)量）進行分析和預測。

2.2.2響應面分析

利用Design Expert 7.0軟件對二次回歸模型進行規(guī)范分析，蔗糖、蛋白胨、檸檬酸鈉、MgSO4及黃嘌呤質(zhì)量濃度之間交互作用對BC產(chǎn)量的影響見圖6。

圖6　各交互因素對BC產(chǎn)量影響的響應面及等高線圖Fig.6　Response surface plots showing the effects of medium components on the yield of BC

結合表2所示方差分析結果，由圖6響應面曲線圖及等高線圖分析可知［15］：黃嘌呤與MgSO4、檸檬酸鈉與MgSO4、黃嘌呤與蛋白胨對BC產(chǎn)量影響的交互作用較強，蔗糖與蛋白胨、蔗糖與MgSO4對BC產(chǎn)量影響的交互作用較弱。同時，黃嘌呤、MgSO4、檸檬酸鈉對BC產(chǎn)量的影響比較顯著，曲線較陡；而蔗糖、蛋白胨對BC產(chǎn)量的影響相對較小，曲線較平緩，其數(shù)值的增加減少，對響應值的變化影響較小。

2.2.3最佳發(fā)酵培養(yǎng)基

由Design Expert 7.0軟件求出回歸模型極值點，對應的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：蔗糖質(zhì)量濃度39.33 g/L、蛋白胨質(zhì)量濃度20.01 g/L、MgSO4質(zhì)量濃度0.91 g/L、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度3.45 g/L、黃嘌呤質(zhì)量濃度1.02 g/L，此條件下，BC的理論產(chǎn)量為6.33 g/L。為檢驗響應面法的可靠性，在最佳培養(yǎng)基條件下進行驗證實驗。此條件下進行3 次平行實驗，BC平均產(chǎn)量為（6.27±0.11） g/L，與預測值接近，說明回歸方程能比較真實地模擬各因素對BC產(chǎn)量的影響，因此，使用該回歸模型優(yōu)化利用酒糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)BC的培養(yǎng)基是可行的。

2.3發(fā)酵產(chǎn)物的結構與性能

圖7　基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）與酒糟水解液發(fā)酵BC（BC-YP）紅外圖譜Fig.7　FT-IR spectraof BC produced from basic culture medium （BC-DZ）and BC from culture medium containing vinasse hydrolysate （BC-YP）

圖8　基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）與酒糟水解液發(fā)酵BC（BC-YP）XXRRDD圖譜Fig.8　XRD of BC produced from basic culture medium （BC-DZ） and BC from culture medium containing vinasse hydrolysate （BC-YP）

酒糟水解液發(fā)酵BC（BC-YP）與基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）紅外圖譜如圖7所示。吸收峰3 285、1 154、1 077、1 040 cm-1證實了樣品中大量—OH的存在；吸收峰2 925、1 383、1 313、667、645 cm-1證實了—CH2—、—CH和C—H的存在；吸收峰1 241 cm-1證實了環(huán)C—O—C的存在；吸收峰1 241、1 033 cm-1證實了直鏈C—O—C的存在［16-17］。以上結果顯示為細菌纖維素葡聚糖的特征吸收，可以推斷出兩種樣品的主要成分均為細菌纖維素。由圖7可知，BC-YP和BC-DZ紅外圖譜基本一致，說明兩種樣品的化學組成非常相似，酒糟水解液作為發(fā)酵原料不影響B(tài)C的化學結構。

酒糟水解液發(fā)酵BC（BC-YP）與基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）XRD圖譜如圖8所示，BC-YP和BC-DZ的X射線圖譜大致相同，且在相同位置處均含有主要衍射峰，分別在144.8°、16.8°和21.7°附近存在3 個衍射峰，此3 個峰分別對應纖維素晶體的＜101＞、＜101＞和＜002＞晶面［18］，據(jù)此可知BC-YP和BC-DZ為Ⅰ型纖維素。

兩種樣品的結晶度與晶體粒徑實驗結果表明，BC-YP和BC-DZ的結晶度基本相同，分別為23.73%及23.95%，BC-YP粒徑為34 nm，BC-DZ粒徑為13 nm。結晶度與纖維的抗張強度、楊氏模量、硬度、伸長率、吸濕性、潤脹度、柔軟性等性質(zhì)有一定的關系［19-20］，說明酒糟水解液作為發(fā)酵原料不影響B(tài)C結晶度。晶體粒徑與透明度、撕裂因子有關，酒糟水解液中含有纖維素未水解完全的多糖成分，部分多糖可在BC合成過程中結合到BC中，從而改變BC的晶體粒徑。

圖9　基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）與酒糟水解液發(fā)酵BC（BC-YYPP）SEM圖譜Fig.9　SEM of BC produced from basic culture medium （BC-DZ） and BC from culture medium with vinasse hydrolysate （BC-YP）

酒糟水解液發(fā)酵BC（BC-YP）與基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）SEM圖譜如圖9所示，BC-YP和BC-DZ均由高密度納米級微纖維相互纏繞形成，具有三維網(wǎng)狀層狀結構［21］。SEM表面和斷面圖譜顯示BC-YP的微纖絲之間有填充物存在。這可能是因為在BC合成過程中，酒糟水解液中的多糖成分能夠直接結合在BC的網(wǎng)狀結構中，這與XRD的檢測結果一致。

3　結 論

通過單因素試驗和響應面法對酒糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)BC的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，建立了蔗糖、蛋白胨、MgSO4、檸檬酸鈉和黃嘌呤5 個因素對BC產(chǎn)量的二次回歸方程模型，經(jīng)檢驗，模型準確有效，可以用該模型分析預測各因素對BC產(chǎn)量的影響。由單因素試驗和響應面優(yōu)化模型確定利用酒糟水解液發(fā)酵生產(chǎn)BC的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：蔗糖39.33 g、蛋白胨20.01 g、MgSO40.91 g、檸檬酸鈉3.45 g、黃嘌呤1.02 g、乙醇10 mL、酒糟水解液1 000 mL、pH 6.0。在此條件下，得到BC產(chǎn)量為6.27 g/L，較優(yōu)化前（4.40 g/L）提高了42.5%。利用FT-IR、XRD、SEM對發(fā)酵產(chǎn)物BC化學基團、結晶性能、微觀結構進行了比較，結果表明，酒糟水解液發(fā)酵產(chǎn)物BC結構性能與基本培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物BC基本一致，酒糟水解液能夠替代部分發(fā)酵原料發(fā)酵生產(chǎn)BC，且不影響B(tài)C性能。

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Optimization of Culture Medium Based on Vinasse Hydrolysate for Acetobacter xylinum by Response Surface Methodology for Enhanced Production of Bacterial Cellulose and Properties of the Product

ZHANG Wen， LIU Kang， LUO Feifei， ZHANG Minjuan， LI Yanjun
（College of Life Science and Engineering， Shaanxi University of Science and Technology， Xi'an 710021， China）

Response surface methodology was used to optimize the fermentation medium based on vinasse hydrolysate for enhanced production of bacterial cellulose （BC）. Meanwhile， the properties and structures of the BC were compared with those obtained with the basic culture medium. According t o the results of single factor experiments and response surface analysis， the optimal medium components were determined as follows： saccharose 39.33 g， peptone 20.01 g， magnesium sulfate 0.91 g， sodium citrate 3.45 g， xanthine 1.02 g， ethanol 10 mL， vinasse hydrolysate 1 000 mL and pH 6.0， yielding 6.27 g/L of BC， which was increased by 42.5% when compared with that before optimization （4.4 g/L）. The properties and structures of BC produced with vinasse hydrolysate were confirmed to be basically the same as those of BC produced with the basic medium through Fourier transform infrared （FT-IR） spectroscopy， X-ray diffraction （XRD） and scanning electron microscopy （SEM）， suggesting that vinasse hydrolysate could be used as an alternative raw material for the fermentation of BC without any influence on the properties of BC.

vinasse； bacterial cellulose； culture medium optimization； response surface methodology； property

TS201.1

A

1002-6630（2015）13-0160-07

10.7506/spkx1002-6630-201513030

2014-07-21

釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室開放基金項目（NJ2012-14）；陜西省2014年省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（0913）

張雯（1982—），女，副教授，碩士，研究方向為生物制藥。E-mail：zwen102@163.com