姜 麗，閆 嬌，王婷婷，郭 琴，王新華，閆春財(cái)

（1.天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387；2.南開(kāi)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津300071）

搖蚊科隸屬雙翅目長(zhǎng)角亞目（Diptera：Nematocera），搖蚊科種類約占淡水湖沼生物區(qū)系的25%，其幼蟲(chóng)生物量約占底棲動(dòng)物總量的70%～80%.由于搖蚊科昆蟲(chóng)具有個(gè)體相對(duì)較大、易獲得、生活習(xí)性多樣、區(qū)域性強(qiáng)、底棲生活等優(yōu)點(diǎn)，因此是監(jiān)測(cè)水體環(huán)境和污染狀況的優(yōu)良指示生物[1].

搖蚊亞科是搖蚊科中僅次于直突搖蚊亞科的第2大亞科，目前對(duì)搖蚊亞科的研究相對(duì)較少.搖蚊亞科有3個(gè)族：搖蚊族（Chironomini，至少 69個(gè)屬）、長(zhǎng)跗搖蚊族（Tanytarsini，至少16屬）和偽搖蚊族（Pseudochironomini，至少5屬）.由于形態(tài)學(xué)和核型特征的不同造成了復(fù)雜的物種多樣性和較小的屬間差異，出現(xiàn)了基因重組和趨同進(jìn)化，導(dǎo)致物種鑒定的難度加大和搖蚊物種分類地位的不明確.為解決這一問(wèn)題，近年來(lái)分子系統(tǒng)學(xué)利用標(biāo)記基因在物種分類方面取得了一些進(jìn)展.這些標(biāo)記基因的特點(diǎn)是多態(tài)性高、共顯性遺傳、選擇中性、容易獲得、容易操作及重復(fù)性好.線粒體細(xì)胞色素氧化酶I基因（COI）自2004年以來(lái)被廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)的條形碼研究[2].迄今，一個(gè)包含超過(guò)8萬(wàn)種昆蟲(chóng)信息的數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)形成[3].廣泛多態(tài)性和豐富的可用數(shù)據(jù)使COI基因成為一個(gè)能夠鑒定物種多樣性的分子系統(tǒng)學(xué)工具.Guryev[4]第一次嘗試基于COI的核苷酸序列和線粒體DNA的細(xì)胞色素b基因（Cytb）研究搖蚊科的系統(tǒng)發(fā)育.然而，Guryev僅利用了幾個(gè)屬（Chironomus、Kiefferulus、Sergentia、Polypedilum和Axarus）建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)反映亞科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.此后，Sharma[5]基于rDNA的ITS1和ITS2建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定了搖蚊族9個(gè)屬的物種地位.Ekrem等[6]基于線粒體COI基因的核苷酸序列獲得了長(zhǎng)跗搖蚊族（Tanytarsini）5個(gè)屬的親緣關(guān)系，包括2個(gè)核基因（FE1和CAD）及3個(gè)線粒體基因（COI、COⅡ和16s RNA）的分析[7].關(guān)于Chironomus和Sergentia的屬內(nèi)關(guān)系[8-11]也有少量報(bào)道.迄今為止，所有的搖蚊亞科系統(tǒng)發(fā)育重建均包含數(shù)目有限的屬和種，屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍然不明確.

本研究基于搖蚊亞科39屬48種的COI基因序列，擬重建搖蚊亞科屬級(jí)之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源

實(shí)驗(yàn)所用的搖蚊樣品主要來(lái)自野外采集，采集方式包括網(wǎng)捕和燈誘.標(biāo)本放置于－20℃的冰箱中保存.經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定，供系統(tǒng)發(fā)育研究的搖蚊樣本詳細(xì)信息如表1所示，在GenBank下載的25種搖蚊COI基因的相關(guān)序列信息如表2所示.

表1 實(shí)驗(yàn)樣品來(lái)源Tab.1 Sourceof samples

表2 25種搖蚊COI基因的相關(guān)信息Tab.2 Information of COI genesof 25 species

1.2 DNA的提取

取頭部、觸角、翅、足、腹部和生殖節(jié)，用加拿大樹(shù)膠做永久裝片，為種類鑒定提供依據(jù)，剩下的胸部用于DNA提取.使用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的血液/細(xì)胞/組織/基因組DNA提取試劑盒，按照使用說(shuō)明書(shū)，微調(diào)部分操作步驟進(jìn)行DNA提取.

1.3 PCR擴(kuò)增

對(duì)COI基因進(jìn)行擴(kuò)增使用的是通用引物L(fēng)CO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和 HCO-2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-CA-3′）.這2個(gè)引物組合能夠擴(kuò)增長(zhǎng)度大約為1 kbp的片段.大多數(shù)個(gè)體都能用這段引物擴(kuò)增得到相應(yīng)序列.

PCR反應(yīng)體系為25μL，包括：ddH2O 16.2μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上游和下游引物（10μmol/L）各 1μL，Taq酶（500 U，2.5 U/μL）0.3μL，DNA 模板2μL.

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min，溫度降低到4℃終止擴(kuò)增.得到的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)符合要求的產(chǎn)物送北京華大基因研究中心測(cè)序.

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和分析

所測(cè)得序列先進(jìn)行校對(duì)，然后在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到的同源序列絕大多數(shù)來(lái)自昆蟲(chóng)綱線粒體基因組細(xì)胞色素氧化酶 I（Cytochrome oxidase I，COI）的目標(biāo)DNA片段，在排除了外源基因污染后，經(jīng)過(guò)比對(duì)再將確認(rèn)無(wú)誤后的序列采用BioEdit 7.01軟件進(jìn)行比對(duì)，去掉兩端不整齊的序列.

2 基于COI基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.1 COI基因序列的堿基組成

利用MEGA5.1軟件對(duì)搖蚊亞科48種搖蚊的基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示.序列總長(zhǎng)度平均為698 bp，序列中各堿基含量的平均值是：A=29.3%，T=37.7%，G=14.7%，C=18.3%，（C+G）含量（33%）遠(yuǎn)低于（A+T）含量（67%），表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚性，這與絕大多數(shù)昆蟲(chóng)線粒體的基因具有一致性.

在比對(duì)的序列中，C（保守位點(diǎn)數(shù)）占69.6%（486/698），V（變異位點(diǎn)數(shù)）占24.6%（172/698），Pi（簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)）占 16.1%（113/698），S（自裔位點(diǎn)數(shù)）占5.73%（40/698）.密碼子第2位點(diǎn)較為保守，其保守位點(diǎn)數(shù)占全部保守位點(diǎn)數(shù)的49.8%（242/486）.密碼子第3位點(diǎn)可變數(shù)占全部可變位點(diǎn)數(shù)的84.8%（146/172），而且簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)也集中在第3位點(diǎn)上，其比例為62.5%，由此可見(jiàn)密碼子第3位點(diǎn)上的堿基進(jìn)化速率較快.

表3 搖蚊亞科48種搖蚊COI基因序列信息Tab.3 Information of COI gene sequencesof 48 species from Chironom inae

2.2 密碼子氨基酸組成分析

對(duì)搖蚊亞科48種搖蚊的密碼子使用頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表4所示.該序列編碼了212種氨基酸，富含AT的密碼子包括：亮氨酸（Leu L）的使用頻率（CU）和相對(duì)使用頻率（RSCU）值范圍分別為2.9～9.0和0.64～1.98；甲硫氨酸（Met M）的CU和RSCU值范圍分別為0.0～1.8和0.00～1.00.富含GC的密碼子包括：甘氨酸（Gly G）的CU和RSCU值范圍分別為0.3～1.6和0.22～1.27；脯氨酸（Pro P）的CU和RSCU值范圍分別為 0.6～3.1和 0.32～1.56；精氨酸（Arg R）的 CU 值和RSCU值范圍分別為0.2～0.6和0.27～0.71.苯丙氨酸（F）使用量最高；其次是異亮氨酸（I）；再次是酪氨酸（Y）.因此COI基因表達(dá)產(chǎn)生的氨基酸在組成上具有一定的偏向性，AT密碼子的相對(duì)使用頻率大于GC密碼子的相對(duì)使用頻率.

表4 搖蚊亞科48種搖蚊的密碼子使用頻率Tab.4 Codon usage frequency of 48 species in Chironom inae

2.3 堿基替換分析

對(duì)搖蚊亞科48種搖蚊的COI基因進(jìn)行堿基替換分析，結(jié)果如表5所示.總轉(zhuǎn)換數(shù)為84，總顛換數(shù)為105，轉(zhuǎn)換略低于顛換.不同密碼子之間的堿基替換具有差異性.密碼子第3位點(diǎn)上出現(xiàn)了較為明顯的堿基替換，替換比例達(dá)到7%（70/189），其中轉(zhuǎn)換占全部轉(zhuǎn)換數(shù)的 34.5%（29/84），顛換占 39%（41/105）.第 2 點(diǎn)位點(diǎn)最為保守，只有26.9%（51/189）的替換率，分別占轉(zhuǎn)換發(fā)生數(shù)的32.1%（27/84），顛換發(fā)生數(shù)的22.8%（24/105）.內(nèi)群平均轉(zhuǎn)換比顛換（R 值）=0.8，小于 1，表明堿基替代未達(dá)到飽和.

表5 搖蚊亞科48種搖蚊COI基因序列基因堿基替換Tab.5 Nucleotidessubstitution of COI gene sequencesof 48 species in Chironom inae

2.4 COI基因序列堿基替換飽和度分析結(jié)果

利用MEGA 5.1軟件對(duì)搖蚊亞科48種搖蚊COI基因進(jìn)行堿基替換飽和度分析，結(jié)果如圖1所示.

圖1 COI基因轉(zhuǎn)換顛換數(shù)與p距離的關(guān)系Fig.1 Relationship between COI gene conversion and transversion with p-distance

從圖1可以看出，轉(zhuǎn)換數(shù)（Ts）和顛換數(shù)（Tv）大部分重合，呈直線分布，隨著p距離的增大而增多，顛換略高于轉(zhuǎn)換，但兩者沒(méi)有明顯的飽和趨勢(shì).同Tv相比，Ts與p距離的線性關(guān)系更強(qiáng)，堿基替換未達(dá)到飽和.推測(cè)顛換數(shù)高于轉(zhuǎn)換數(shù)的原因與COI序列中（A+T）含量較高有關(guān)，因?yàn)楦撸ˋ+T）含量增加了A-T顛換的幾率.

2.5 遺傳距離分析

計(jì)算48種搖蚊之間未校正的p距離，結(jié)果顯示：搖蚊亞科內(nèi)各屬間p距離的變化范圍為0.061～0.183；而外群環(huán)足搖蚊屬與搖蚊亞科間的p距離的變化范圍則為0.013～0.156，所有序列的平均p距離為0.201.

2.6 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的構(gòu)建

以環(huán)足搖蚊屬的5個(gè)種作為外群，使用MEGA5.1軟件構(gòu)建基于Kimura-2-parameter模型的鄰接法（NJ）和最大簡(jiǎn)約法（MP）的48種搖蚊的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果如圖2和圖3所示.以重復(fù)抽樣分析（Bootstrap test）1 000次來(lái)檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度.2種建樹(shù)方法得到的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致.

圖2 基于COI基因序列構(gòu)建的48種搖蚊的NJ樹(shù)Fig.2 NJ tree of 48 speciesof Chironom inae based on COI gene sequences

圖3 基于COI基因序列構(gòu)建的48種搖蚊的MP樹(shù)Fig.3 MP tree of 48 species of Chironom inae based on COI gene sequences

3 討論

本研究中NJ樹(shù)和MP樹(shù)形成的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本相似，所反映的部分屬間關(guān)系情況大致相同.搖蚊亞科的2個(gè)屬群的進(jìn)化基本得到了解決，出現(xiàn)了2個(gè)明顯的進(jìn)化枝.總體上系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系支持了形態(tài)學(xué)上鑒定的屬和大部分種的地位.搖蚊亞科包括兩大有區(qū)別的集群：搖蚊族和長(zhǎng)跗搖蚊族，它們?cè)诩s8 500萬(wàn)年以前開(kāi)始分化，這些族的代表屬在形態(tài)學(xué)特征上有顯著不同.目前分類學(xué)家分辨出的Pseudochironomini的代表屬在Dillon等[11]構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育圖中沒(méi)有形成一個(gè)分支，Pseudochironomus sp.和Chironomini的屬在一個(gè)進(jìn)化枝上，其分類地位還不明確.搖蚊亞科和直突搖蚊亞科的代表種形成約在104萬(wàn)年以前，與古生物學(xué)家鑒定的白堊紀(jì)搖蚊[12]的形態(tài)相一致.105萬(wàn)年以前的一個(gè)搖蚊亞科的代表—狹搖蚊屬，從搖蚊亞科和直突搖蚊亞科之間單獨(dú)形成一支.在本研究中，多足搖蚊屬群中的內(nèi)搖蚊屬（Endochironomus Kieffer）、倒毛搖蚊屬（Microtendipes Kieffer）、明搖蚊屬（Phaenopsectra Kieffer）和斑搖蚊屬（Stictochironomus Kieffer）很好地聚集在一起，有很近的親緣關(guān)系，與形態(tài)學(xué)的分類一致.分類學(xué)家依據(jù)一些相似的特征（如觸角13鞭節(jié)，下唇須5節(jié)，中足具一內(nèi)一外2根短脛距及偶爾外脛距退化，上、下附器、肛尖形狀變異情況以及有或無(wú)中附器等）將11個(gè)近緣的屬聚為多足搖蚊屬群.長(zhǎng)跗搖蚊屬群中桿長(zhǎng)跗搖蚊屬（Virgatanytarsus）和長(zhǎng)跗搖蚊屬（Tanytarsus），小突搖蚊屬（Micropsectra）和流長(zhǎng)跗搖蚊屬（Rheotanytarsus）很好地聚集在了一起，與形態(tài)學(xué)的分類一致，還有一些同屬群的物種個(gè)體并沒(méi)有聚類在一起.Cranston[13]在1989年編制的屬級(jí)鑒別特征，依據(jù)非常長(zhǎng)的中附器、V型的臀板帶、肛尖頂尖、指附器未伸出上附器內(nèi)緣等相似特征將31個(gè)近緣屬聚為長(zhǎng)跗搖蚊屬群，但是其中泉搖蚊屬（Krenopsectra）和長(zhǎng)跗搖蚊屬（Tanytarsus）聚為姐妹群，這與形態(tài)學(xué)分類有明顯差異.多數(shù)基于形態(tài)學(xué)研究的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示：狹搖蚊屬（Stenochironomus）和明搖蚊屬（Phaenopsectra）互為姐妹群，但是在本研究中這2個(gè)類群并沒(méi)有聚合在一起形成姐妹群關(guān)系.在本文中顯示較高支持率的姐妹群為：阿克西搖蚊屬（Axarus）和異足搖蚊屬（Apedilum）、二叉搖蚊屬（Dicrotendipes）和枝角搖蚊屬（Cladopelma）.由于目前尚無(wú)分子系統(tǒng)學(xué)和形態(tài)學(xué)研究的相關(guān)報(bào)道，本文結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證，在今后研究中需要增加更多的基因序列進(jìn)行聯(lián)合分析.

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