陳麗春，梁祥輝，龔金炎，*

（1.浙江科技學(xué)院浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310023；2.浙江工商大學(xué)食品感官科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310035）

大孔樹脂純化洋甘菊中總黃酮的工藝條件研究

陳麗春1，2，梁祥輝1，龔金炎1，*

（1.浙江科技學(xué)院浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310023；2.浙江工商大學(xué)食品感官科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310035）

對(duì)大孔樹脂純化洋甘菊中總黃酮工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究。建立紫外-可見分光光度法測(cè)定洋甘菊中總黃酮方法；以吸附率、解吸率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察樹脂類型、上樣濃度、上樣體積、洗脫濃度、洗脫體積對(duì)純化工藝的影響。通過繪制靜態(tài)吸附平衡曲線、泄露曲線和動(dòng)態(tài)解吸曲線，綜合評(píng)判確定最優(yōu)工藝。結(jié)果表明：AB-8樹脂對(duì)洋甘菊中總黃酮純化效果較好，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為1.8 mg/mL，上樣體積流量為1 BV/h；洗脫劑用70%乙醇，體積流量為1.0 BV/h對(duì)洋甘菊中總黃酮的吸附率為62.5%、解吸率68%、回收率61%。經(jīng)AB-8大孔樹脂純化洋甘菊中總黃酮提高25.3%，此方法穩(wěn)定可靠，可用于洋甘菊總黃酮的工業(yè)純化要求。

洋甘菊；大孔樹脂；總黃酮；分離純化

洋甘菊（Matricaria chamomilla L）又名母菊，木蘭綱菊科母菊屬草本，一年生或兩年生草本植物。原產(chǎn)歐洲，為一種重要的藥用和香料植物。黃酮類化合物（Favonoids）是一類廣泛存在于植物莖葉和植物果實(shí)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要以苷元形式存在。洋甘菊所含黃酮類成分主要有芹菜苷、蘆丁、木犀草素、槲皮素等，現(xiàn)代藥理研究表明洋甘菊中的黃酮類成分具有抗菌、抗氧化、消炎效果，具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，可預(yù)防體內(nèi)形成過多活性氧自由基，達(dá)到抗癌、抗心血管病的目的［1］。洋甘菊含揮發(fā)油、黃酮類、愈創(chuàng)奠內(nèi)酯、香豆素類等成分，具有獨(dú)特的香氣，在歐洲、美國(guó)及日本等國(guó)家被廣泛用于食品、飲料、煙草、化妝品等領(lǐng)域，是一種很有開發(fā)潛力的經(jīng)濟(jì)植物，不少國(guó)家加以大面積機(jī)械化生產(chǎn)［2］。沙紅等［3］曾對(duì)洋甘菊的組織培養(yǎng)進(jìn)行過研究。楊彥松等［4］對(duì)新疆洋甘菊頭狀花序中的黃酮類化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從其95%乙醇提取物中分離得到2個(gè)黃酮類化合物，通過波譜方法分別鑒定為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（I）和木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（Ⅱ）。作為一種引進(jìn)植物，洋甘菊在我國(guó)尚未得到充分的開發(fā)及利用。本研究運(yùn)用現(xiàn)代分離技術(shù)對(duì)洋甘菊中提取的黃酮類化合物進(jìn)行分離提純研究，確定大孔樹脂分離純化洋甘菊中黃酮類物質(zhì)的可行性與最優(yōu)工藝，以為工業(yè)化分離提純洋甘菊中黃酮類物質(zhì)提供理論參考。

1材料與方法

1.1原料與試劑

羅馬洋甘菊：新疆種植，購于杭州，于40℃真空干燥，密封保存。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品：上海醫(yī)藥化學(xué)試劑公司；AB-8、D-101、DM-130、HP-20、XDA-1型大孔吸附樹脂：廣州綠百草生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；水為超純水。

1.2儀器與設(shè)備

UV-5500紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；Direct-QR3 MILLIPOR E（France）超純水；HL-2S恒流泵：上海瀘西分析儀器廠；TS-1102雙層大容量恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R E-2000：上海亞榮生化儀器廠；KQ-50E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；電子天平：北京丹佛儀器有限公司；GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3方法

1.3.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，用甲醇溶解，稀釋并定容成0.1 mg/mL對(duì)照品溶液，備用。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置7個(gè)25 mL量瓶中，加入0.1 mol/L AlCl3溶液2.0 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置20 min。以試驗(yàn)溶劑為空白，在420 nm處測(cè)定吸光度（A），A值（Y）對(duì)蘆丁質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程y=0.121 7x-0.008 9，R2=0.999 6。結(jié)果表明總黃酮在0.004mg/mL～0.02mg/mL線性關(guān)系良好，可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3洋甘菊供試品的制備

準(zhǔn)確稱取洋甘菊干粉（過40目）適量，按料液比為1∶24，加入70%乙醇，在70℃回流浸提2.5 h，抽濾得洋甘菊提取液，濃縮，經(jīng)真空冷凍得洋甘菊樣品，按“1.3.2項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”測(cè)定其總黃酮含量，備用。

1.3.4大孔樹脂靜態(tài)預(yù)處理

將已經(jīng)水合的樹脂裝入柱中，樹脂床高度約為柱的2/3，待樹脂沉降后先進(jìn)行反洗，將加入95%乙醇，使有機(jī)溶劑液面高于樹脂床面，浸泡2 h～6 h。再用去離子水淋洗樹脂床，洗去有機(jī)溶劑，通過2%～4%的鹽酸溶液，用量約為3倍～5倍樹脂體積，并用去離子水淋洗至中性。再通過4倍～5倍樹脂體積的4%的NaOH溶液，水洗至中性待用。

1.3.5測(cè)定方法

吸取經(jīng)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附后的溶液1.00 mL溶液置于10 mL容量瓶中，加入1%AlCl32.00 mL，加甲醇定容至刻度，按“1.3.2項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”測(cè)定其吸光度，分別按照下列公式計(jì)算樹脂吸附量（Q）、吸附率、解吸率。

式中：A為總黃酮吸附量，mg/mL；B為初始的黃酮量，mg；B1為未被吸附的黃酮量，mg；V為溶液總體積，mL；Q1為吸附率，%；Q2為解吸率，%；B2為乙醇解吸液中的黃銅總量，mg。

1.4洋甘菊總黃酮大孔樹脂的分離純化工藝參數(shù)的確定

1.4.1大孔樹脂的篩選

精確稱取抽濾至干的D-101、AB-8、DM-130、HP-20、XDA-1樹脂各5 g置于具塞錐形瓶中，分別加入已知濃度的洋甘菊溶液40 mL，置于恒溫?fù)u床，溫度25℃，120 r/min的速率振蕩吸附12 h后，取瓶中溶液，按“1.3.5測(cè)定方法”測(cè)定溶液的吸光度并計(jì)算總黃酮含量，分別計(jì)算樹脂吸附量及吸附率。

取上述吸附后的樹脂，吸濾后，用適量的水沖洗，分別加入70%乙醇50 mL，置于恒溫?fù)u床中進(jìn)行解吸，測(cè)定解吸液中總黃酮的量。

1.4.2靜態(tài)吸附平衡曲線的測(cè)定

精確稱取抽濾至干AB-8樹脂5 g，置于具塞錐形瓶中，加入濃度為2.00mg/mL的洋甘菊供試溶液40mL，置于溫度25℃，速率120 r/min的恒溫?fù)u床振蕩，分別于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、28 h取樣，測(cè)定樹脂對(duì)總黃酮的吸附率，以吸附率對(duì)時(shí)間作圖，繪制AB-8樹脂對(duì)總黃酮的靜態(tài)吸附平衡曲線。

1.4.3上樣濃度的考察

用已處理好的AB-8樹脂裝柱，精密量取供試品，配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的洋甘菊供試品溶液，上樣體積流量為1 BV/h，分別收集過柱流出液，按“1.3.2測(cè)定方法”測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附率。

1.4.4洗脫劑濃度的考察

取已處理過的AB-8樹脂（徑高比1∶25）分別裝9支，配制1.80mg/mL洋甘菊上樣溶液，以流速1 BV/h上樣，待AB-8樹脂柱吸附飽和后，分別用乙醇體積分?jǐn)?shù)為0、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇洗脫，洗脫流速為1 BV/h，收集流脫液，按“1.3.2測(cè)定方法”測(cè)定吸光度，計(jì)算洗脫液中總黃酮含量，并計(jì)算解吸率。

1.4.5洋甘菊中總黃酮在AB-8上的泄露曲線

用處理好AB-8樹脂裝柱（徑高比1∶25），配制1.80 mg/mL洋甘菊上樣溶液，按體積流量1 BV/h上樣。收集分段流出液，按“1.3.2測(cè)定方法”測(cè)定其吸光度，并計(jì)算總黃酮含量，當(dāng)樹脂達(dá)到吸附飽和時(shí)，記錄上樣量，以流出液中總黃酮質(zhì)量濃度對(duì)上樣體積作圖，繪制泄露曲線。

2結(jié)果與討論

2.1大孔樹脂的篩選

大孔樹脂的篩選結(jié)果見圖1。

圖1　五種大孔樹脂的吸附與解吸曲線Fig.1Influence of five resins on absorptionand desorption rates of total flavonoids

在D-101、AB-8、DM-130、HP-20、XDA-1 5種樹脂中AB-8樹脂的吸附量和解吸量都是最高，其次是D-101樹脂，效果相對(duì)較差的是XDA-1，結(jié)果見圖1。

2.2靜態(tài)吸附平衡曲線的確定

AB-8樹脂對(duì)洋甘菊溶液靜態(tài)吸附過程，通過測(cè)定AB-8樹脂對(duì)洋甘菊總黃酮的吸附情況，繪制AB-8樹脂對(duì)總黃酮的靜態(tài)吸附平衡曲線。結(jié)果見圖2。

圖2　AB-8樹脂靜態(tài)吸附平衡曲線的測(cè)定Fig.2AB-8 Macroporous resin Static Adsorption Curve

從曲線中可以看出，在開始吸附中，AB-8樹脂對(duì)洋甘菊中總黃酮的吸附率較高，當(dāng)吸附6 h后達(dá)到最高吸附率；吸附10 h后樹脂對(duì)總黃酮吸附率基本不再變化，基本達(dá)到吸附平衡。

2.3上樣濃度樹脂吸附的影響

洋甘菊供試品上樣濃度對(duì)AB-8樹脂對(duì)總黃酮的吸附效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　不同上樣濃度對(duì)AB-8樹脂吸附總黃酮的影響Fig.3Influence of AB-8 resin on adsorption rate at different sample concentrations of total flavonoids

由圖可見洋甘菊上樣濃度為1.5 mg/mL～1.8 mg/mL達(dá)到最佳吸附條件，當(dāng)上樣濃度過高或過低并不利于AB-8樹脂對(duì)洋甘菊中總黃酮的吸附。

2.4洗脫劑濃度對(duì)樹脂解吸率的影響

當(dāng)采用不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行洗脫時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，解吸率不斷提高。結(jié)果見圖4。

圖4　洗脫劑濃度對(duì)解吸率的影響Fig.4Relationship between solvents and desorption rate of total flavanoids

從圖中可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，解吸效果達(dá)到最佳，隨后，乙醇的體積分?jǐn)?shù)的增加對(duì)解吸率的影響并不明顯。從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，在工業(yè)上可以采用洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.5洋甘菊總黃酮在AB-8上的泄露曲線

洋甘菊總黃酮在AB-8上的泄露曲線見圖5。

圖5　AB-8大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.5Dynamic adsorption curve of AB-8 resin

AB-8樹脂處理3倍以上樹脂體積的上樣溶液時(shí)即開始有部分總黃酮成分泄露，處理9倍樹脂床體積后，流出液中總黃酮的質(zhì)量濃度基本不再增加，表明AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)總黃酮的吸附量達(dá)到吸附平衡。

2.6驗(yàn)證試驗(yàn)

將已處理過的AB-8樹脂裝柱，以質(zhì)量濃度為1.80 mg/mL洋甘菊供試品，上樣流速為1 BV/h，上樣吸附30 min后，測(cè)得上樣體積。用水過柱洗脫至無色。以70%乙醇為洗脫液，流速為1 BV/h洗脫，測(cè)得洗脫劑用量。并收集乙醇洗脫液，測(cè)定其總黃酮的量。計(jì)算AB-8樹脂對(duì)洋甘菊供試品的吸附率、解吸率、回收率。平行實(shí)驗(yàn)3次。結(jié)果顯示：AB-8樹脂對(duì)洋甘菊供試品的吸附率62.5%、解吸率68%、回收率61%；經(jīng)AB-8大孔樹脂純化洋甘菊供試品中總黃酮提高25.3%。

3結(jié)論與討論

應(yīng)用大孔吸附樹脂分離純化洋甘菊中黃酮類化合物的有效成分，在食品工業(yè)及制藥業(yè)等領(lǐng)域具有十分遼闊的前景。樹脂的吸附能力由樹脂孔徑、比表面積、表面電性或形成氫鍵等綜合性能決定，一般情況下，非極性吸附樹脂適合從極性溶液吸附非極性物質(zhì)，反之亦然。與其他純化方法比較，在富集有效成分，減少雜質(zhì)方面有其突出的優(yōu)越性。洋甘菊提取液經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂處理后，總黃酮收率在60%以上，洋甘菊供試品中總黃酮提高25.3%。的方法。本實(shí)驗(yàn)所建立洋甘菊總黃酮分離純化工藝條件的優(yōu)化條件，與其他純化方法相比，具有較高的富集和純化效率，利于洋甘菊總黃酮工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。

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Enrichment and Purification Technology for Total Flavonoids from Chamomile by Macroporous Resin

CHEN Li-chun1，2，LIANG Xiang-hui1，GONG Jin-yan1，*
（1.Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemical&Bio Processing Technology of Farm Produces，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2.College of Food and Biology Engineering，Sensory Science Laboratory，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，Zhejiang，China）

The purification process of total flavonoids from chamomile on macroporous resins was studied in this research.An UV-vis spectrophotometry method to determine the content of total flavonoids in chamomile was established.The adsorption equilibrium capacities and desorption ratios were measured as the evaluation indexes，and the effects of the factors such as resin type，initial concentration，sample volume，elution concentration and elution volume were determined.Static adsorption isotherms，adsorption kinetic curves and adsorption breakthrough curves were measured and compared，and the optimal conditions of the purification process were obtained as follows：the AB-8 resin，initial concentration 1.8 mg/mL，adsorption flow rate 1 BV/h，desorption solvent 70%ethanol，desorption flow rate 1.0 BV/h.At those conditions，the adsorption capacity ratio of the total flavonoids from chamomile was 62.5%，the desorption ratio was 68%and the recovery ratio was 61%.The content of the total flavonoids from chamomile extract could be increased to 25.3%through the purification process on macroporous resin.This method was stable and reliable，could meet the purification requirements of the total flavonoids from chamomile for industrial production.

chamomilia；macroporous；flavonoids；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.029

2014-03-03

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012C22026）；重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（2013KF0901）

陳麗春（1975—），女（漢），副教授，博士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物研究與功能產(chǎn)品開發(fā)。