張　志，張美晶，董雅琴，王　佳，吳發(fā)興，劉　爽，邵衛(wèi)星，李曉成，王樹雙

（中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島　266032）

豬用疫苗中牛病毒性腹瀉病毒污染的檢測與分析

張志，張美晶，董雅琴，王佳，吳發(fā)興，劉爽，邵衛(wèi)星，李曉成，王樹雙

（中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032）

為調(diào)查我國豬用疫苗中牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）的污染情況，本文用巢式RT-PCR方法檢測了部分藍(lán)耳病弱毒疫苗和豬瘟細(xì)胞苗中的牛病毒性腹瀉病毒，并分析其核酸序列的遺傳特性，結(jié)果共檢測出9份BVDV陽性樣品，分子遺傳分析表明污染的牛病毒性腹瀉病毒分別屬于BVDV的1a型和1b型。

牛病毒性腹瀉病毒；PCR；豬瘟；豬藍(lán)耳??；疫苗

我國的生豬產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的50%以上，但同時(shí)我國養(yǎng)豬場的豬病也極為復(fù)雜，豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病、豬流行性腹瀉等疫病廣為流行。目前我國豬群重大疫病的防控主要依賴疫苗免疫，因此疫苗的質(zhì)量高低就直接關(guān)系到我國生豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。豬用商品化疫苗以弱毒疫苗為主。弱毒疫苗具有可誘導(dǎo)體液和細(xì)胞雙重免疫、只接種一次即可起到良好的預(yù)防效果、持續(xù)時(shí)間長、不需佐劑等優(yōu)點(diǎn)。但是，弱毒疫苗的使用可能導(dǎo)致如下問題：易受外源病毒污染、發(fā)生交叉感染、有毒力殘留等。疫苗一旦被污染以后，不僅疫苗使用效價(jià)降低，起不到預(yù)防和控制傳染病的功效，甚至還會(huì)造成疾病的傳播。

我國豬用弱毒疫苗中，屢有外源病原污染情況，常見污染源為支原體和牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）［1］。牛病毒性腹瀉病毒自首次被報(bào)道以來，在全世界很多畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家中流行［2］，如：澳大利亞、德國等國家豬群中BVDV抗體陽性率達(dá)3%～40%，荷蘭達(dá)15%～20%。各種年齡的牛都可感染牛病毒性腹瀉，以幼齡牛易感性最高，在垂直傳播后，會(huì)產(chǎn)生病毒血癥［3］。以含BVDV的血清作為原料時(shí)，就會(huì)污染制備的生物制品，如豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)過程中會(huì)使用到牛睪丸細(xì)胞以及牛血清；藍(lán)耳病疫苗（尤其是弱毒疫苗）生產(chǎn)工藝中在傳代細(xì)胞培養(yǎng)中會(huì)使用到牛血清，如果血清材料含有BVDV病原或抗體，會(huì)使豬瘟細(xì)胞苗和藍(lán)耳病疫苗污染［3-4］。豬瘟活疫苗BVDV污染在我國早已有報(bào)道［5］，但近年來，我國豬瘟細(xì)胞苗和豬藍(lán)耳病弱毒疫苗生產(chǎn)廠家都有數(shù)十家之多，若不能及時(shí)監(jiān)測出疫苗中BVDV污染情況，會(huì)造成重大經(jīng)濟(jì)損失甚至?xí)?dǎo)致傳染病的流行。因此，對(duì)豬瘟和藍(lán)耳病疫苗受BVDV污染情況的監(jiān)測與分析十分有必要。本文擬采用套式RT-PCR方法對(duì)CSF和PRRS弱毒疫苗污染BVDV情況進(jìn)行檢測與分析，這對(duì)指導(dǎo)畜牧業(yè)生產(chǎn)中科學(xué)使用疫苗有重要的意義。

1　材料與方法

1.1疫苗

豬瘟細(xì)胞苗和豬藍(lán)耳病弱毒疫苗為14個(gè)省份送來的招標(biāo)疫苗。這些疫苗每只用5 mL 0.01M的滅菌PBS溶解后，備用。

1.2試驗(yàn)試劑

RNA提取試劑Trizol，購自?nvitrogen公司；RT-PCR Kit，購自大連寶生物公司。

1.3RNA提取

取稀釋的疫苗250 μL加入750 μL Trizol，振蕩混勻后，室溫放置5 min，加入氯仿250 μL，劇烈振蕩后，室溫放置10 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取500 μL上清，加入等量異丙醇，混勻，-80℃沉淀30 min后4℃ 12 000 r/min離心10 min，去上清，沉淀用1 mL 75%的乙醇洗滌，4℃ 12 000 r/min離心5 min棄上清，室溫干燥RNA沉淀20 min，加入30 μL DEPC水，充分溶解后-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4巢式RT-PCR擴(kuò)增

［6］建立的巢氏PCR方法，設(shè)計(jì)合成了2對(duì)引物，用于巢式RT-PCR擴(kuò)增，引物序列位于BVDV的NS5B基因，詳見表1。

第一次擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：Enzyme Mix 1 μL，2×1 Step Buffer 12.5 μL，P1（20 μM）0.5 μL，P2（20 μM）0.5 μL，RNA 3 μL，DEPC水7.5 μL，反應(yīng)總體積為25 μL。反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。第二次擴(kuò)增時(shí)取第一次PCR產(chǎn)物作為模板，反應(yīng)體系為：Ex-Taq 0.5 μL，2×1 Step Buffer 12.5 μL，P3（20 μM）0.5 μL，P4（20 μM）0.5 μL，一擴(kuò)PCR產(chǎn)物2 μL，DEPC水9 μL，反應(yīng)總體積為25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94 ℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，選擇出現(xiàn)特異性條帶的樣品送至上海生工公司進(jìn)行測序。

1.5序列分析

從GenBank上下載BVDV相關(guān)的參考毒株，共20株（表2），分別來自日本、美國、加拿大、中國等的不同的基因型，序列分析采用DNAStar、CLUSTAL1.83和MEGA6.06軟件，分析疫苗中污染的BVDV毒株的核苷酸同源性，并繪制了NS5B基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2　結(jié)果

2.1巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果

以疫苗提取的RNA為模板，采用P1、P2引物進(jìn)行RT-PCR的產(chǎn)物再以P3、P引物巢式PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)豬藍(lán)耳病弱毒疫苗中有6個(gè)樣品為陽性（樣品編號(hào)為BVDV16，BVDV17，BVDV18，BVDV19，BVDV20和BVDV21），豬瘟細(xì)胞苗有3份為陽性（編號(hào)為BVDV26，BVDV27和BVDV30），詳見圖1和圖2。

表1　BVDV擴(kuò)增的引物

表2 BVDV參考序列

圖1 豬藍(lán)耳病疫苗BVDV 巢式擴(kuò)增結(jié)果

圖2 豬瘟細(xì)胞苗BVDV 巢式擴(kuò)增結(jié)果

圖3　BVDV不同毒株的進(jìn)化樹分析

2.2進(jìn)化樹分析

將這9份陽性樣品測序后進(jìn)行BLAST分析發(fā)現(xiàn)，這9份樣品全部為BVDV毒株，進(jìn)一步與BVDV參考毒株進(jìn)行進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，這些BVDV可以分為BVDV 1型和2型兩個(gè)進(jìn)化分支，其中BVDV 1型為優(yōu)勢分支，它又可以分為1a和1b兩個(gè)亞型，1a為參考毒株或經(jīng)典毒株的進(jìn)化分支。本文檢測的9株BVDV中，來自豬瘟疫苗的3個(gè)毒株BVDV-26、27、30和來自豬藍(lán)耳病疫苗的BVDV-17、18、19均屬于1a分支，而另外3個(gè)來自豬藍(lán)耳病疫苗的BVDV16、20、21屬于1b分支（圖3），并且來自豬瘟疫苗的BVDV19和來自豬藍(lán)耳病疫苗的BVDV27位于同一個(gè)更小的進(jìn)化分支內(nèi)，這提示二者可能有共同的來源。

2.3同源性比較

本文從疫苗中所測的9株BVDV污染毒株之間的同源性為80.7%～99.4%，其中，BVDV-26和BVDV-30毒株之間的同源性最高，為99.4%，BVDV-20和BVDV-30毒株之間的同源性最低，僅為80.7%。9株BVDV與參考株NC_001461的同源性為82.8%-86.8%，與其他BVDV 1型毒株的同 源 性 為78.8%～96.0%，與BVDV 2型毒株的同源性為69.6%～76.8%，與外類群HCLV-AF091507的同源性為68.9%～73.0%（圖4）。

3　討論

BVDV是疫苗中常見的一種污染源，由于BVDV毒株在細(xì)胞上難以產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，因此PCR方法就成為最常用的BVDV檢測方法［1］?？紤]到BVDV與CSFV和BDV均屬于黃病毒屬，三者在基因組上的同源性較高，常規(guī)的PCR擴(kuò)增容易因交叉反應(yīng)而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性，本文在試驗(yàn)前首先對(duì)國內(nèi)外PCR檢測方法進(jìn)行了篩選比較，最后確定采用NS5B區(qū)的一段保守序列進(jìn)行擴(kuò)增的套式引物，該引物可以有效區(qū)分BVDV和CSFV，同時(shí)具有較高的靈敏度［6］。本文的檢測結(jié)果也充分表明了該檢測方法的可行性和有效性。

圖4　BVDV各毒株的同源性比較結(jié)果

近年來，一些學(xué)者對(duì)疫苗中的外源病原污染進(jìn)行了研究，2008年，范學(xué)政等［5］報(bào)道豬瘟疫苗中BVDV的感染率為21.74%；2011年，葉兆美等［7］對(duì)四川市售的豬藍(lán)耳病疫苗和豬瘟疫苗進(jìn)行了檢測，結(jié)果10份豬瘟疫苗和9份豬藍(lán)耳病疫苗中BVDV的污染率為10.53%；2011年，范仲鑫等［8］對(duì)湖南省內(nèi)的48個(gè)批次的豬瘟疫苗進(jìn)行了BVDV檢測，陽性率為18.75%。這些檢測結(jié)果提示我國豬用疫苗中BVDV的污染較為嚴(yán)重。

從本次豬藍(lán)耳病疫苗和豬瘟疫苗中檢測BVDV的基因型來看，6株為1a型，3株為1b型，這一結(jié)果與牛群中BVDV的血清型分布類似［2，9］，提示這些疫苗中的BVDV污染很可能來自牛血清中的BVDV持續(xù)性感染所致。因此，要進(jìn)一步加強(qiáng)血清的檢測和監(jiān)管，避免帶毒血清流入市場。

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（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Detection and Analysis of Bovine Viral Diarrhea Virus Contamination in Classical Swine Fever and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vaccines

Zhang Zhi，Zhang Meijing，Dong Yaqin，Wang Jia，Wu Faxing，Liu Shuang，Shao Weixing，Li Xiaocheng，Wang Shushuang
（ China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

To investigate BVDV contamination in classical swine fever （CSF） and porcine reproductive and respiratory syndrome （PRRS） vaccines，vaccine samples were collected and detected by nest RT-PCR for BVDV，resulting in 9 positive BVDV-contaminated vaccine samples. The contaminating BVDVs were identified as BVDV type 1a and 1b.

bovine viral diarrhea virus；PCR；classical swine fever；porcine reproductive and respiratory syndrome；vaccine

S859.79+7

A

1005-944X（2015）11-0076-04

科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012FY111000）；青島市民生計(jì)劃項(xiàng)目（13-1-3-91-nsh）

李曉成