郝霽萍　高宇勤△　賀少輝　趙國(guó)平

（1.陜西省西安市第九醫(yī)院，陜西西安710054；2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510632）

·研究報(bào)告·

芍藥苷預(yù)處理激活PPARα對(duì)在體大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)的作用研究*

郝霽萍1高宇勤1△賀少輝1趙國(guó)平2

（1.陜西省西安市第九醫(yī)院，陜西西安710054；2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510632）

目的探究芍藥苷預(yù)處理通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARα）信號(hào)通路對(duì)大鼠在體心肌缺血再灌注損傷發(fā)揮的干預(yù)作用。方法采用結(jié)扎SD大鼠心臟LDA的方法建立在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，利用0.5%Evan’s藍(lán)灌注心肌及1%TTC磷酸緩沖液孵育心肌來(lái)觀察心肌壞死利用HE染色觀察心肌損傷程度，利用酶聯(lián)免疫吸附法觀察大鼠血清中腫瘤壞死因子（TNF-α）、細(xì)胞黏附因子（ICAM-1）的含量，蛋白印跡（Western blot）技術(shù)檢測(cè)芍藥苷預(yù)處理對(duì)PPARα的影響。結(jié)果芍藥苷藥物預(yù)處理組與缺血再灌注組比較，心肌梗死面積明顯減?。≒＜0.01）；芍藥苷預(yù)處理能促進(jìn)PPARα蛋白的表達(dá)，減少血清中TNF-α、ICAM-1的含量。結(jié)論芍藥苷預(yù)處理能減輕大鼠在體心肌缺血再灌注損傷，可能通過(guò)增加PPARα蛋白的表達(dá)，抑制TNF-α、ICAM-1分泌，減少炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)作用。

芍藥苷心肌缺血再灌注損傷過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體

缺血再灌注損傷病理過(guò)程涉及到炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、凋亡等機(jī)制，特別是炎癥反應(yīng)，有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARα）可以調(diào)控涉及到炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)［1-2］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)PPARα的配體貝特類調(diào)脂藥可以減輕非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷［3-4］。也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PPARs是NF-κB信號(hào)通路的上游調(diào)控因子，PPARα活化后可以抑制NF-κB的活化和核內(nèi)定位，并進(jìn)一步減少腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)［4］。芍藥苷是單萜糖苷類化合物，是毛茛科植物芍藥干燥根中的一種生物活性成分。有研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用［5］。但是對(duì)于心肌缺血再灌注損傷研究較少。因此如果芍藥苷預(yù)處理能減輕心肌缺血再灌注損傷，那么其機(jī)制是否可能與PPARα激活相關(guān)，為了驗(yàn)證此假說(shuō)，本實(shí)驗(yàn)采用在體SD大鼠冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）結(jié)扎術(shù)模型來(lái)觀察芍藥苷預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的心肌保護(hù)作用及與PPARα信號(hào)通路的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量280～400 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002。

1.2試劑與儀器芍藥苷購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司（批號(hào)ZL20090409SYG），抗PPARα（抗鼠一抗）抗體，購(gòu)自SANTA CRUZ生物技術(shù)公司；TNF-α、細(xì)胞黏附因子（ICAM-1）試劑盒購(gòu)置于凱基生物技術(shù)公司，其余皆為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.3分組與給藥30只雄性SD大鼠被隨機(jī)分為3組，每組10只，每組中4只進(jìn)行心梗面積及缺血面積測(cè)定，另外6只進(jìn)行其他指標(biāo)測(cè)定，3組分別為：假手術(shù)組（此組只開(kāi)胸，但不結(jié)扎LAD）、缺血再灌注組、芍藥苷預(yù)處理組。芍藥苷與生理鹽水混合，于灌胃前加熱溶解混均，藥物預(yù)處理組大鼠給予芍藥苷100 mg/kg灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃4 d，最后1次于手術(shù)前30 min給予。

1.4模型制備將大鼠稱體質(zhì)量，注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，固定大鼠仰臥于手術(shù)臺(tái)，剪除頸部和胸部被毛，碘伏消毒，縱形剪開(kāi)頸部皮膚約2～3 cm，分離皮下組織及肌肉，顯露氣管，鈍性分離氣管并帶線，行氣管插管，接呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸頻率60次/min、通氣量20 mL/kg。胸骨左緣3 mm縱形剪開(kāi)皮膚約4 cm，鈍性分離皮下、胸大肌與前鋸肌，于三肋間逐步剪開(kāi)肋間肌，撐開(kāi)肋骨，撕破心包，顯露心臟，確定縫扎位置（肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處下方2 mm，前降支LAD近端位置）。用0號(hào)線，疊一個(gè)0.8～1 mm的凹槽硅膠管，出針打結(jié)結(jié)扎LAD，缺血30 min，松開(kāi)結(jié)扎，復(fù)灌2 h。模型復(fù)制的可靠性用ECGⅡ?qū)?lián)的變化來(lái)判斷，以ST段抬高為心肌缺血存在，以ST段回落1/2為再灌注成功。本實(shí)驗(yàn)建模總共有4只SD大鼠因?yàn)槁樽砗褪中g(shù)原因死亡，死亡率13%。

圖1　大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立成功的心電圖表現(xiàn)

1.5標(biāo)本采集及檢測(cè)

1.5.1心肌梗死面積測(cè)定實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)取出心臟（心臟仍在活鼠身上，未游離），原位結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈主干，經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌注（壓力為80 mmHg）0.5%Evan’s藍(lán)2～3 mL，立即取心臟，以預(yù)冷生理鹽水沖洗殘余血液，將左室與其他心肌組織分離，快速置于液氮中，取出冷凍心臟，延左室長(zhǎng)軸方向連續(xù)環(huán)切，每片2～3 mm，正常心肌組織為藍(lán)色，缺血區(qū)心肌組織為粉色，分離無(wú)藍(lán)染缺血區(qū)和藍(lán)染非缺血區(qū)，濾紙吸干，分別稱質(zhì)量。然后將無(wú)藍(lán)染缺血心肌置入1%TTC磷酸緩沖液（pH7.4）中37℃孵育20 min，此時(shí)壞死區(qū)呈灰白色，非壞死區(qū)呈深紅色，其后將壞死區(qū)和非壞死區(qū)分離，濾紙吸干，置于電子天平上稱質(zhì)量。梗死面積以壞死心肌質(zhì)量與缺血心肌質(zhì)量（壞死區(qū)與非壞死區(qū)之和）之比表示。

1.5.2血清TNF-α、ICAM-1檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法，再灌注結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血3 mL，收集于非抗凝離心管內(nèi)，靜置30 min，在4℃下以4000 r/min離心10 min，取出上清液，檢測(cè)血清中TNF-α、ICAM-1的含量，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.5.3心肌PPARα蛋白表達(dá)檢測(cè)采用蛋白印跡（Western blot）法，配制分離膠的配制濃度：8%分離膠，制備5%濃縮膠，上液蛋白總量80μg，進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜條件：PPARα蛋白檢測(cè)用350 mA恒流濕轉(zhuǎn)45 min。一抗孵育條件：anti-PPARα（1∶1000），anti-GAPDH（1∶2000），4℃孵育過(guò)夜，二抗（1∶5000）。將Western blot ECL發(fā)光液A、B各500 μL等量混合后，涂在PVDF膜上，覆蓋膠片，在暗房中，曝光，掃描儀掃描Western blot圖像，Quantity one軟件分析Western blot條帶的灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1芍藥苷預(yù)處理對(duì)心肌梗死面積影響見(jiàn)圖2和表1。結(jié)果表明，芍藥苷預(yù)處理組與缺血再灌注組比較，心肌梗死面積明顯減?。≒＜0.01）。

圖2　芍藥苷預(yù)處理對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

表1　各組心肌梗死面積比較（%，±s）

表1　各組心肌梗死面積比較（%，±s）

與缺血再灌注組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別n芍藥苷預(yù)處理組4假手術(shù)組4缺血再灌注組4心梗面積0.14±0.03**0 0.37±0.06

2.2芍藥苷預(yù)處理對(duì)大鼠血清中TNF-α、ICAM-1含量的影響見(jiàn)表2。芍藥苷預(yù)處理組與缺血再灌注組相比較，能減少TNF-α、ICAM-1的含量（均P＜0.05）。

表2　各組血清TNF-α和ICAM-1水平比較（ng/L，±s）

表2　各組血清TNF-α和ICAM-1水平比較（ng/L，±s）

組別n藥物預(yù)處理組10假手術(shù)組10缺血再灌注組10 TNF-αICAM-1 32.74±4.25*22.08±1.62*22.65±3.12*19.23±1.12*45.84±5.9436.20±3.13

2.3芍藥苷預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌PPARα蛋白的影響見(jiàn)圖3和表3。結(jié)果顯示，芍藥苷預(yù)處理組能促進(jìn)PPARα蛋白的表達(dá)，與缺血再灌注組比較有明顯差異（P＜0.01）；說(shuō)明藥物預(yù)處理組能明顯增加PPARα蛋白的表達(dá)。

圖3　芍藥苷預(yù)處理對(duì)大鼠心肌PPARα的影響

表3　各組大鼠心肌PPARα表達(dá)比較（灰度值，±s）

表3　各組大鼠心肌PPARα表達(dá)比較（灰度值，±s）

組別n藥物預(yù)處理組6假手術(shù)組6缺血再灌注組6 PPARα 1.05±0.04**0.64±0.05 0.33±0.03

3　討論

心肌缺血再灌注損傷的病理過(guò)程涉及到炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷等機(jī)制，此病理過(guò)程涉及到多種信號(hào)通路調(diào)控，其中PPARα就是其中一個(gè)重要信號(hào)通路。PPARα屬于非甾體類核受體超家族，存在于機(jī)體大部分組織，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PPARs是NF-κB信號(hào)通路的上游調(diào)控因子，PPARα活化后可以抑制NF-κB的活化和核內(nèi)定位，并進(jìn)一步減少TNF-α的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)［4］。有研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用［5］。因此本實(shí)驗(yàn)提出一個(gè)假說(shuō)：芍藥苷預(yù)處理減輕心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制之一可能與PPARα激活相關(guān)。為驗(yàn)證此假說(shuō)，實(shí)驗(yàn)采用在體LAD結(jié)扎術(shù)模型，通過(guò)檢測(cè)芍藥苷預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心梗面積的影響發(fā)現(xiàn)，芍藥苷預(yù)處理能明顯減少模型大鼠心肌梗死面積，而且通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、ICAM-1含量發(fā)現(xiàn)，芍藥苷預(yù)處理能明顯降低模型大鼠血清中的TNF-α、ICAM-1的含量。目前研究發(fā)現(xiàn)PPARα活化能抑制炎癥因子TNF-α、ICAM-1的釋放［6］，因此筆者再次假設(shè)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的芍藥苷預(yù)處理能明顯降低模型大鼠血清中的TNF-α、ICAM-1的含量可能與PPARα信號(hào)通路激活有關(guān)。于是本實(shí)驗(yàn)利用蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)心肌組織中的PPARα蛋白含量，發(fā)現(xiàn)芍藥苷預(yù)處理能明顯升高PPARα蛋白含量，所以通過(guò)上述結(jié)果認(rèn)為芍藥苷預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護(hù)作用部分是通過(guò)增加PPARα蛋白表達(dá)，進(jìn)而減少炎癥因子TNF-α、ICAM-1的表達(dá)，最后抑制炎癥反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)為芍藥苷應(yīng)用于保護(hù)心肌缺血再灌注損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)干預(yù)心肌缺血再灌注損傷的中藥制劑提供初步研究。本實(shí)驗(yàn)是在體實(shí)驗(yàn)，還需要開(kāi)展芍藥苷對(duì)原代心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的影響以進(jìn)一步探究芍藥苷的保護(hù)效應(yīng)是通過(guò)全身系統(tǒng)發(fā)揮作用，還是局部發(fā)揮作用。

［1］Hecker M1，Behnk A，Morty RE，et al.PPAR-α activation reduced LPS-induced inflammation in alveolar epithelial cells［J］.Exp Lung Res，2015，7：1-11.

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Effects of Paeoniflorin Pretreatment by Activating PPARα on the Rats with Myocardial Ischemia Reper-fusion Injury

HAO Jiping，GAO Yuqin，HE Shaohui，et al.The Ninth Hospital of Xi′an，Shaanxi，Xi′an 710054，China

Objective：To explore the effects of paeoniflorin preconditioning by activating PPARα on the rats with myocardial ischemia reperfusion injury.Methods：Myocardial ischemia reperfusion injury model was estab lished by cardiac LDA ligation in SD rats.The degree of myocardial injury was observed by perfusion of 0.5% Evan′s blue and 1%TTC.HE staining was used to observe the degree of myocardial injury.The content of TNF-α and ICAM-1 in serum were detected with ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent）.Western blot technology was used to explore the effects of paeoniflorin pretreatment on PPARα.Results：In comparison with ischemic reperfusion group，paeoniflorin pretreatment could decrease infarction area significantly（P＜0.01），reduce the contents of TNF-α and ICAM-1 significantly（P＜0.05）and increase the expression of PPARα.Conclusion：The effect of paeoniflorin preconditioning on rats with myocardial ischemia reperfusion injury may be probably related to the increase of the expression of PPARα and the decrease tof he contents of TNF-α and ICAM-1 in serum

Paeoniflorin；Myocardium ischemia reperfusion injury；PPARα（Peroxisome proliferator-activated receptors alpha）

R285.5

A

1004-745X（2015）11-1888-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.003

2015-08-26）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81173189）；西安市衛(wèi)生局科技項(xiàng)目；西安市科技項(xiàng)目資助（SF1416）

（電子郵箱：gaoyuqin1234567@aliyun.com）