楊潔，王紅娟，豆智華，李冠

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830046)

雙峰駝是新疆特色產(chǎn)乳家畜之一，已經(jīng)形成一定的養(yǎng)殖規(guī)模，其乳制品的品種與產(chǎn)量逐年增加.中國是世界雙峰駝主要分布國家之一，存欄量約50萬峰以上，主要分布在新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、青海等省區(qū)約110萬平方公里的干旱荒漠草原上；從分布的數(shù)量來看，新疆占全國總數(shù)的52%左右.中國的雙峰駝主要有新疆駝（XinJiang camel）、內(nèi)蒙古阿拉善駝（Alxa camel）和內(nèi)蒙古蘇尼特駝（Sunite camel）三個優(yōu)良種群.與牛乳相比，駱駝乳及其發(fā)酵制品是最有營養(yǎng)價(jià)值的乳品之一，具有獨(dú)特的營養(yǎng)成分，駱駝乳的氨基酸質(zhì)量水平高于FAO/WHO/UNU對氨基酸的要求，并富含多不飽和脂肪酸，可廣泛用于治療包括胃潰瘍、腹瀉、糖尿病、肺結(jié)核、貧血、營養(yǎng)不良、慢性肝炎等在內(nèi)的許多疾病[1?3].

駱駝乳白色，不透明，有甜味或者咸味，是由于駱駝在沙漠中攝食的植物不同而造成的.新鮮駱駝乳的pH值為6.5～6.7，總固形物含量略低于牛乳.主要成分為：蛋白質(zhì)3.1±0.5%，脂肪3.5±1.0%，乳糖4.4±0.7%，灰分0.79±0.07%，總固形物11.9±1.5%[4].蛋白質(zhì)是駱駝乳中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，主要包括酪蛋白和乳清蛋白兩大類.乳清蛋白中含有大量生物活性蛋白，如免疫球蛋白、α-乳白蛋白、乳過氧化物酶、溶菌酶和乳鐵蛋白等，還有一些其他與生物功能相關(guān)的蛋白質(zhì).與牛乳相比，駱駝乳中乳清蛋白含量高，乳糖含量低，缺少β-乳球蛋白，營養(yǎng)成分非常接近人乳[5,6].因此，駱駝乳可以作為對牛乳蛋白質(zhì)過敏嬰幼兒，以及乳糖不耐癥患者的食物蛋白質(zhì)來源[7,8].有研究顯示，駱駝乳對酒精誘導(dǎo)的肝損傷小鼠具有治療或保護(hù)作用；可抑制模型鼠血清脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)肝損傷細(xì)胞的凋亡；對慢性腎功能衰竭大鼠的病情有緩解作用，對糖尿病大鼠具有輔助治療的效果[9?12].近幾年，關(guān)于駝乳的防癌抗癌作用也有了初步研究，王初一、郭建功等發(fā)現(xiàn)蘇尼特雙峰駝鮮駝乳與其自然發(fā)酵乳對小鼠H22肝癌腫瘤細(xì)胞的生長有一定的抑制作用，對小鼠H22肝癌腫瘤組織的PCNA表達(dá)有下調(diào)作用，并具有增強(qiáng)腫瘤小鼠免疫功能的作用[13,14].

目前，國內(nèi)外對駝乳輔助治療腫瘤方面的研究極為有限，對駝乳抗腫瘤的分子機(jī)制研究未見報(bào)道.前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，駝乳對食管癌及其他多種腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用；利用蛋白質(zhì)分離手段結(jié)合抑癌活性追蹤篩選的方法，我們從駝乳清蛋白中分離出具有抑癌活性的蛋白質(zhì)組分TR35.為此，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察駝乳抑癌活性的組分TR35對人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖、凋亡的影響，探討其作用機(jī)制，為駝乳資源的合理利用提供理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 樣品與試劑

駝乳樣品采自新疆烏魯木齊市鴻雁池、烏拉泊等地牧民在半荒漠草地散養(yǎng)的新疆雙峰駝.樣品采集后立即置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，分離得TR35組分，凍干，-20?C儲藏備用.

人宮頸癌Hela細(xì)胞株(由新疆大學(xué)新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供).DMEM的培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，噻唑藍(lán)（MTT）和二甲基甲砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品，胰蛋白酶(Trypsin)，（NH4）2SO4，NaCl，NaH2PO4，Na2HPO4，HCl，NaOH等均為國產(chǎn)分析純.Hochest33258，Annexin VFITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，碘化丙啶染色液（PI）檢測試劑盒購自江蘇碧云天試劑有限公司.

1.2 儀器

FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀（美國BD公司）；Benchmark Plus酶標(biāo)儀（中國上海）；H-600透射電子顯微鏡（日本日立公司）；LEO1430VP掃描電子顯微鏡（德國LEO公司）；Heal Force Neofuge 13R臺式高速冷凍離心機(jī)(香港力康發(fā)展有限公司).

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌HeLa細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng).培養(yǎng)環(huán)境為37?C、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.4 MTT法測定駝乳清蛋白TR35對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，胰酶消化后，計(jì)數(shù)，使懸液細(xì)胞數(shù)達(dá)到5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL細(xì)胞懸液，置CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng).待細(xì)胞完全貼壁后，每孔加入200μL終濃度為8、4、2、1、0.5 mg/mL的TR35，陽性對照藥物5-氟尿嘧啶20μg/mL，于37?C、5%CO2飽和濕度分別培養(yǎng)24、48和72 h.然后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20μL，繼續(xù)溫育4 h，終止培養(yǎng)，棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150μL DMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解.酶標(biāo)儀測定490 nm波長吸光度值(OD)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，按公式：

抑制率%=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)／(陰性對照細(xì)胞OD值-空白組)]×100%

半數(shù)抑制濃度IC50的測定：IC50的測定方法同MTT實(shí)驗(yàn)相同，將樣品連續(xù)倍比稀釋后，測定每個濃度對細(xì)胞的抑制率，根據(jù)樣品濃度與抑制率的反應(yīng)曲線，用作圖法求出半數(shù)抑制濃度(IC50).

1.5 細(xì)胞形態(tài)的顯微觀察

1.5.1 細(xì)胞顯微形態(tài)觀察

取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，胰酶消化后，計(jì)數(shù)，使懸液細(xì)胞數(shù)達(dá)到5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL細(xì)胞懸液，置CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng).待細(xì)胞完全貼壁后，每孔加入200μL終濃度為2、1、0.5 mg/mL的TR35，陽性對照藥物為5-氟尿嘧啶20μg/mL，于37?C、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)24 h后在倒置差相顯微鏡下觀察細(xì)胞顯微形態(tài).

1.5.2 Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)

收集處理24 h后Hela細(xì)胞，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL的固定液(甲醇：冰乙酸=3:1)固定15 min.去固定液，用PBS洗兩遍（每次3 min）去除液體，加入0.5 mL Hochest 33258染色液，避光染色5 min，晃動數(shù)次，熒光顯微鏡下觀察.

1.6 細(xì)胞超顯微形態(tài)觀察

1.6.1 掃描電鏡觀察細(xì)胞外部形態(tài)

收集處理24 h后Hela細(xì)胞放入2.5%戊二醛中，CO2臨界點(diǎn)干燥，粘貼樣品，離子濺射鍍膜，掃描電子顯微鏡下觀察.

1.6.2 透射電鏡觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)

收集處理24 h后Hela細(xì)胞放入2.5%戊二醛中，用1%的鋨酸固定，常規(guī)乙醇脫水包埋，超薄切片，醋酸鈉和檸檬酸鉛雙重染色后透射電鏡觀察.

1.7 Annenxin V/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡

將Hela細(xì)胞接種于六孔板內(nèi).細(xì)胞數(shù)量1×105/mL，每孔2 mL.置于CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng).待細(xì)胞完全貼壁后，每孔加入不同濃度的TR35.每個梯度設(shè)三個復(fù)孔，每孔終體積為2 mL.作用24 h后，PBS洗滌2次，收集細(xì)胞約1×106/mL，1 000×g離心2 min，PBS 3 mL，洗滌2次，1 000 r/min離心2 min，棄上清，3 mL PBS混勻，400目尼龍網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心2 min，棄上清.將細(xì)胞懸于500μL Binding buffer中，混勻后加入5μL Annenxin V-FITC和10μL PI，混勻后室溫避光15 min，轉(zhuǎn)入流式管后上流式細(xì)胞儀（FCM）檢測，計(jì)數(shù)2～3萬個細(xì)胞.

1.8 PI單染測定細(xì)胞周期

收集處理24 h后Hela細(xì)胞，加入冰預(yù)冷無水乙醇固定，4?C過夜.離心棄去固定液，1 mL PBS重懸，1 000 r/min離心5 min，棄上清.用1 mL PI染液染色，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測.

1.9 線粒體膜電位檢測

收集處理24 h后的Hela細(xì)胞，PBS洗滌，重懸于0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中.加入0.5 mL JC-1染色工作液混勻.37?C孵育20 min.離心棄上清，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次：棄上清.再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分析.

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 4.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以x±s表示，計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行方差分析，P<0.01為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

圖1 駝乳清蛋白組分TR35對Hela細(xì)胞的抑制作用（24 h）（p＜0.01）

2 結(jié)果

2.1 駝乳清蛋白組分TR35對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用

分別以不同濃度的駝乳清蛋白組分TR35處理HeLa細(xì)胞，分別于24、48和72 h后用MTT實(shí)驗(yàn)檢測其對細(xì)胞增殖作用的影響.結(jié)果顯示，TR35對Hela細(xì)胞的增殖有抑制作用，其半數(shù)抑制濃度IC50為0.064 mg/mL；隨著作用時(shí)間的延長和濃度的增加，TR35對HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增加，且呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，結(jié)果見圖1.

2.2 駝乳清蛋白組分TR35對Hela細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2.1 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

駝乳清蛋白組分TR35處理Hela細(xì)胞24 h后，采用倒置相差顯微鏡觀察其顯微.陰性對照組中，Hela細(xì)胞貼壁生長，呈梭形或多邊形，融合成片，細(xì)胞透亮，胞體肥厚，細(xì)胞間相互連接，邊界清晰.在0.5 mg/mL的TR35作用下，細(xì)胞密度略有減少，細(xì)胞形態(tài)也有微小變化；隨著蛋白濃度增加至1 mg/mL，細(xì)胞體積漸縮小，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞表面漸凸起小膜泡，邊界不清晰，折光性增強(qiáng)，脫壁細(xì)胞逐漸增多；當(dāng)濃度達(dá)到2 mg/mL時(shí)，大部分細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)基中，貼壁的細(xì)胞形態(tài)明顯變化，基本已看不清細(xì)胞原來的形態(tài).由圖2可以看出，駝乳清蛋白TR35對Hela細(xì)胞顯微形態(tài)有顯著的影響.

圖2 駝乳清蛋白組分TR35對Hela細(xì)胞形態(tài)的影響24h（×200)

2.2.2 TR35-50誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察

用Hoechst 33258對經(jīng)駝乳清有效蛋白組分對Hela細(xì)胞作用24 h后染色觀察，正常細(xì)胞呈正常形態(tài)，可以看到細(xì)胞質(zhì)的延伸，細(xì)胞均勻分布，經(jīng)駝乳清組分TR35誘導(dǎo)后，細(xì)胞聚集成團(tuán)，染色質(zhì)高度凝集，有凋亡小體出現(xiàn)，顯示出細(xì)胞凋亡的特征，見圖3.

圖3 駝乳清蛋白組分TR35誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡形態(tài)（×200)

2.3 駝乳清組分TR35對Hela細(xì)胞外部形態(tài)的影響

掃描電鏡觀察TR35組分對Hela細(xì)胞外部形態(tài)的影響.由圖4可知，陰性對照組細(xì)胞表面有豐富的微絨毛，規(guī)則排列，細(xì)胞間鑲嵌連接，細(xì)胞膜完整，且細(xì)胞體積較大.當(dāng)TR35組分處理時(shí)，細(xì)胞微絨逐漸消失，細(xì)胞間連接逐漸疏松，細(xì)胞胞體固縮，甚至裂解開有內(nèi)容物溢出.

圖4 掃描電鏡觀察駝乳清蛋白組分TR35對Hela細(xì)胞外部形態(tài)的影響

2.4 駝乳清組分TR35對Hela細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡觀察TR35組分對細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響，由圖5可以看出，陰性對照組細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞器形態(tài)完整，體積較大，細(xì)胞核異染色質(zhì)呈斑點(diǎn)狀均勻分布,線粒體嵴清晰；隨著駝乳清有效組分TR35濃度的增加，細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)均變得疏松，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)出現(xiàn)邊聚現(xiàn)象，細(xì)胞核碎裂，核固縮，線粒體空泡化，嵴脫落或消失，并有次級溶酶體出現(xiàn)，細(xì)胞膜局部破損，細(xì)胞內(nèi)容物泄出的現(xiàn)象.

圖5 透射電鏡觀察駝乳清有效蛋白組分作用Hela細(xì)胞后細(xì)胞凋亡形態(tài)

通過光鏡和電鏡形態(tài)學(xué)觀察可見用TR35處理組有較多的腫瘤細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象.電鏡下腫瘤細(xì)胞形態(tài)呈典型的凋亡細(xì)胞特征表現(xiàn)，如細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮邊聚、胞質(zhì)濃縮、核碎裂以及凋亡小體形成，目前電鏡形態(tài)學(xué)觀察被認(rèn)為是證實(shí)凋亡的最可靠方法，且與Hoechst33258熒光染色觀察結(jié)果一致.

2.5 Annenxin V/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡

不同濃度TR35組分處理Hela細(xì)胞24 h后，早期凋亡的細(xì)胞數(shù)相對對照組細(xì)胞數(shù)由2.7%分別增加到11.70%、32.1%和58.8%.正常細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)相對于對照組細(xì)胞數(shù)96.0%分別減少到83.9%、63.5%和32.8%，結(jié)果見圖6.

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測駝乳清蛋白組分TR35對Hela細(xì)胞凋亡的影響(24 h)

晚期凋亡和壞死細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)相對陰性對照組細(xì)胞數(shù)0.8%分別增加到2.4%、3.0%和7.7%，并且具有極顯著差異，量效關(guān)系明顯.

2.6 PI單染法檢測細(xì)胞周期

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束到下一次分裂終了的過程，細(xì)胞周期分為G1期、S期、G2期和M期，其中最關(guān)鍵的是S期，此期細(xì)胞進(jìn)行DNA倍增和染色體復(fù)制，是增殖的關(guān)鍵時(shí)期.駝乳清TR35組分作用Hela細(xì)胞24 h后，G0/G1期細(xì)胞隨其濃度的增加而減少，S期細(xì)胞隨著其濃度的增加而增加，而G2/M期細(xì)胞數(shù)沒有發(fā)生變化，說明TR35處理Hela細(xì)胞后，細(xì)胞周期主要阻滯在S期，結(jié)果見圖7.

圖7 駝乳清蛋白組分TR35對Hela細(xì)胞對細(xì)胞周期的影響(24 h)（p＜0.01）

圖8 TR35對Hela細(xì)胞線粒體膜電位的影響（24 h）（p＜0.01）

2.7 TR35處理對Hela細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體是為細(xì)胞提供能量的細(xì)胞器，也是調(diào)控凋亡通路的細(xì)胞器，線粒體膜電位的迅速下降使電子傳遞和呼吸鏈解偶聯(lián)，造成細(xì)胞凋亡[15].

不同濃度TR35處理Hela細(xì)胞24 h后，隨著TR35濃度的增加，正常線粒體膜電位的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，線粒體膜電位下降的細(xì)胞數(shù)逐漸增加，即Hela細(xì)胞線粒體膜電位逐漸降低.由圖8可知，對照組中線粒體膜電位下降細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的7.97%，而在處理組中分別占到53.2%、73.02%和93.08%，具有極顯著差異（p＜0.01），并呈量效關(guān)系.

3 結(jié)論

駝乳清抑癌組分TR35對人宮頸癌Hela細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性；細(xì)胞顯微形態(tài)明顯變化，出現(xiàn)典型的凋亡特征.同時(shí)觀察到該組分可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞線粒體膜電位去極化，并將細(xì)胞周期阻滯在S期，以此推測駝乳清抑癌組分TR35誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡應(yīng)與線粒體通路有關(guān).

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)重要的半自主性細(xì)胞器，唯一擁有獨(dú)立于細(xì)胞核基因組外的遺傳物質(zhì)，在能量代謝、氧自由基的產(chǎn)生、維持鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡、衰老以及腫瘤中發(fā)揮著極為重要的作用.線粒體代謝抑制劑可用于癌癥治療，是目前抗腫瘤藥研發(fā)的重要方向之一.

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，宮頸癌是新疆地區(qū)高發(fā)腫瘤，死亡率居女性惡性腫瘤之首.如何控制宮頸癌的生長及轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步提高其治療效果仍是宮頸癌研究的難題之一，尋找具有抗腫瘤活性的副作用小的新型藥物是目前宮頸癌的研究熱點(diǎn)之一.近年來，駝乳的抗癌作用受到廣泛關(guān)注，在新疆少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，很早就有采用駱駝乳作為抑制腫瘤細(xì)胞生長的輔助治療手段的記載，但是對其抗腫瘤活性成分研究的報(bào)道尚不多見，作用機(jī)理尚不明確.本研究對新疆雙峰駝乳抑癌活性組分體外抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖作用進(jìn)行初步研究，為深入探索其作用機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).