劉玉梅，王利平，白珊珊，徐海寧

(1.新疆大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214000)

啤酒花被譽(yù)為“啤酒的靈魂”[1]，對(duì)啤酒的風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用.按照啤酒花的α-酸含量及其用途不同，國(guó)際上通常將啤酒花分為優(yōu)質(zhì)香型花、香型花、苦型花和高酸型花等幾大類[2].業(yè)界普遍認(rèn)為，香型啤酒花是賦予啤酒特殊的酒花香氣的關(guān)鍵因素[3]，因此，對(duì)香型啤酒花的風(fēng)味成分及其在啤酒中的含量變化研究較多[4?6]，而苦型啤酒花的添加主要是提供了啤酒獨(dú)特的苦味和防腐作用，對(duì)其風(fēng)味成分的研究關(guān)注較少.由于在啤酒釀造過(guò)程中，香型啤酒花通常在麥汁煮沸結(jié)束前幾分鐘添加，而苦型啤酒花則常在麥汁煮沸的過(guò)程中添加，在啤酒中的利用率要明顯高于香型啤酒花[7]，而我們近期的研究也表明，苦型啤酒花的品種和數(shù)量對(duì)最終啤酒的酒花風(fēng)味也會(huì)產(chǎn)生明顯的影響[8].中國(guó)盡管也是啤酒花的原產(chǎn)地之一，但啤酒花的品種（特別是在國(guó)際上具有競(jìng)爭(zhēng)力的啤酒花品種）相對(duì)較少.馬可波羅啤酒花是新疆引種培育的一個(gè)高α-酸的啤酒花新品種，因產(chǎn)量高，加工性能好，近年來(lái)種植面積逐漸擴(kuò)大.本研究以馬可波羅啤酒花為研究對(duì)象，采用HS-SPME-GC-MS分析方法，以質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和保留指數(shù)（Kovats retention indices RI）計(jì)算相結(jié)合的方法進(jìn)行定性，用面積歸一化來(lái)定量，對(duì)馬可波羅顆粒啤酒花、啤酒花浸膏，分子蒸餾精油和水蒸氣蒸餾的精油的主要成分的組成和含量信息進(jìn)行了比較性研究，以期能為啤酒廠的生產(chǎn)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬可波羅啤酒花：由新疆三寶樂農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供；C6-C26正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于Sigmaaldrich公司.

1.2 儀器設(shè)備

Finnigan Trace MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；手動(dòng)SPME進(jìn)樣器，100μmPDMS萃取頭，美國(guó)SUPELCO公司產(chǎn)品；MD-S80分子蒸餾裝置，廣州漢維機(jī)電有限公司；121-50-2型超臨界萃取裝置，江蘇華安南通超臨界CO2萃取有限公司；實(shí)驗(yàn)室水蒸氣蒸餾裝置

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

馬可波羅顆粒啤酒花：馬可波羅啤酒花顆粒經(jīng)脫氣充氮包裝處理后，在-2?C以下儲(chǔ)藏，使用前取出粉碎.

馬可波羅水蒸氣蒸餾酒花油：將上述顆粒啤酒花粉碎后置于試驗(yàn)室自制的水蒸氣蒸餾裝置中進(jìn)行蒸餾，得到馬可波羅啤酒花的水蒸氣蒸餾樣品.

馬可波羅啤酒花浸膏：采用超臨界CO2萃取的方法，將前述顆粒啤酒花粉碎后放入超臨界CO2萃取的萃取釜中，控制萃取溫度45?C，萃取壓力25 MPa，分離溫度65?C，分離壓力6 MPa，CO2流速20L/h，循環(huán)萃取2h，得到馬可波羅啤酒花浸膏樣品.

分子蒸餾啤酒花油：將上述步驟獲得的馬可波羅啤酒花浸膏樣品于60?C水浴中預(yù)先融化后，置于MDS80的分子蒸餾裝置的貯料罐中，打開系統(tǒng)真空系統(tǒng)，控制體系真空度在2～3Pa，蒸餾溫度65?C的條件下，以500 mL/h的物料流速進(jìn)行蒸餾1h，得到分子蒸餾馬可波羅啤酒花油樣品.

1.3.2 分析條件

色譜柱：PEG20M毛細(xì)管色譜柱，30 m×0.25 mm×0.25μm；檢索譜庫(kù)：NIST2005、Wiley7.0；色譜條件：起始柱溫35?C，保留2 min，以8?C/min速度升溫至100?C，然后再以6?C/min的速度升溫至230?C，保留6 min，載氣He，不分流進(jìn)樣，恒流0.8 mL/min，進(jìn)樣口溫度250?C，接口溫度250?C；質(zhì)譜條件：離子源溫度200?C，電離方式EI+，電子能量70 eV，發(fā)射電流200μA，檢測(cè)器電壓350V，掃描質(zhì)量范圍33～453 amu.

采用靜態(tài)頂空固相微萃取法：取0.2 g上述各種啤酒花樣品放入6 mL頂空瓶中，于50?C的水浴中用已老化至無(wú)雜質(zhì)峰的萃取頭吸附40 min，然后進(jìn)GC-MS分析.

1.3.3 定性定量分析

通過(guò)譜庫(kù)檢索、保留指數(shù)RI的計(jì)算值與文獻(xiàn)值[9,10]進(jìn)行比對(duì)，對(duì)成分進(jìn)行定性，定量采用峰面積歸一化來(lái)計(jì)算.保留指數(shù)計(jì)算如下：

其中TR(x)，TR(z)，TR(z+1)分別為被分析組分和碳原子數(shù)處于Z和Z+1之間的正構(gòu)烷烴的流出峰的調(diào)整保留時(shí)間(min).

2 結(jié)果分析

啤酒花采收后由于水分含量高，不易儲(chǔ)存，需將其烘干、壓縮、打包后冷藏存放，在釀造啤酒時(shí)粉碎后直接加入麥汁煮沸鍋中.由于壓縮啤酒花體積較大，儲(chǔ)存不便，而且儲(chǔ)存過(guò)程中活性成分損失較快，釀酒過(guò)程的利用率也較低.因此，近20多年來(lái)，為了提高啤酒花的儲(chǔ)藏品質(zhì)，也為了減少存放空間，通常在不添加任何添加劑的條件下將干燥的啤酒花粉碎后壓制成長(zhǎng)15 mm、直徑6 mm左右的短棒狀，然后進(jìn)行真空充氮包裝，這就是所謂的“顆粒啤酒花”.啤酒花顆粒在成分上與啤酒花一致，完全保持了其特有的風(fēng)味特征，在儲(chǔ)存和使用上都比壓縮啤酒花更為方便，但并未從根本上解決其利用率低的問題.目前，采用超臨界CO2萃取技術(shù)獲得的啤酒花浸膏，因能基本上保持啤酒花的主要特征風(fēng)味已在國(guó)內(nèi)外啤酒廠中大量使用.由于啤酒花浸膏不但可以節(jié)省儲(chǔ)存空間，在長(zhǎng)期的保存過(guò)程中活性成分也比較穩(wěn)定，在一定程度上還可以緩解由于啤酒花產(chǎn)量過(guò)剩而給農(nóng)民帶來(lái)的損失.馬可波羅啤酒花是近年來(lái)新培育的高酸型苦型花品種，為了考察加工過(guò)程對(duì)啤酒花揮發(fā)性成分的影響，也為了給啤酒生產(chǎn)廠家提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考，本實(shí)驗(yàn)采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法（HS-SPME-GC-MS），在分析了啤酒花顆粒的揮發(fā)性成分基礎(chǔ)上，比較了在加工過(guò)程中，不同的加工工藝對(duì)馬可波羅啤酒花揮發(fā)性成分所產(chǎn)生的影響.圖1為馬可波羅顆粒啤酒花樣品的總離子流圖.

圖1 馬可波羅啤酒花代表性樣品的總離子流圖（顆粒啤酒花）

為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的一致性，文中采用同一批次生產(chǎn)的啤酒花來(lái)完成實(shí)驗(yàn)，采用頂空固相微萃取的方法不僅分析速度和檢測(cè)靈敏度高[11,12]，而且也保證了對(duì)樣品中揮發(fā)性成分的前處理過(guò)程的一致性.由于啤酒花揮發(fā)性成分以萜烯和倍半萜烯類物質(zhì)為主，存在很多結(jié)構(gòu)相近的同分異構(gòu)體，這類化合物的質(zhì)譜碎片相似，僅以質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)定性尚不夠準(zhǔn)確.為了使得定性結(jié)果更為可靠，本實(shí)驗(yàn)采用C6-C26的正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照，對(duì)分離的色譜峰保留指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，并通過(guò)與同類型色譜柱所查閱的文獻(xiàn)值進(jìn)行比較，最終確定樣品中的各組分組成信息.文獻(xiàn)中記載的保留指數(shù)與本實(shí)驗(yàn)中所采用的色譜柱及升溫程序并非完全一致，故文中檢索到的部分樣品的保留指數(shù)與文獻(xiàn)值并不完全一致，僅可作為定性的參考.

表1為HP-SPME-GC-MS分析馬可波羅啤酒花的結(jié)果，其中二氧化碳浸膏、分子蒸餾精油和水蒸氣蒸餾精油僅列出顆粒酒花中存在的共有組分.

表1 HP-SPME-GC-MS分析馬可波羅啤酒花的揮發(fā)性成分及其提取物中共有組分

表1 續(xù)HP-SPME-GC-MS分析馬可波羅啤酒花的揮發(fā)性成分及其提取物中共有組分

表1 續(xù)HP-SPME-GC-MS分析馬可波羅啤酒花的揮發(fā)性成分及其提取物中共有組分

由表1的數(shù)據(jù)可知，馬可波羅顆粒啤酒花共鑒定出96個(gè)組分，占總峰面積的99.25%，其主要揮發(fā)性成分是以2-β-蒎烯、β-香葉烯、d-檸檬烯、β-羅勒烯、1,3,8-對(duì)薄荷三烯、古巴烯、β-石竹烯、α-葎草烯、δ-杜松烯、依蘭油烯、γ-杜松烯、α-蛇床烯、β-蛇床烯、3,7(11)-桉葉二烯、1S,cis-菖蒲萜烯等為代表的萜烯類化合物和以丙酮、里哪醇、α-桉葉油醇、4-癸烯酸甲酯、乙酸香葉酯等為代表的含氧化合物，主要化合物組成為碳?xì)漕惢衔?、脂類、醇類、以及少量的醛、酮、酸類和萜烯類氧化?與顆粒酒花相比，馬可波羅酒花浸膏中的共有組分峰面積為96.94%，分子蒸餾的酒花精油中共有組分的總峰面積為92.03%，而水蒸氣蒸餾的酒花精油中的共有峰的峰面積僅為81.81%.說(shuō)明在加工過(guò)程中，啤酒花的風(fēng)味發(fā)生了一定的變化，特別是水蒸氣蒸餾的啤酒花精油，由于較長(zhǎng)時(shí)間的高溫作用，其中的成分發(fā)生了比較明顯的轉(zhuǎn)變[14].表1中的數(shù)據(jù)還可以看出，不僅總的峰面積發(fā)生的變化，共有組分的組成成分和含量也發(fā)生了較大的變化.四種啤酒花樣品中的共有揮發(fā)性成分的組成及含量見表2.

表2 四種啤酒花樣品中的共有揮發(fā)性組分的比較

表2的數(shù)據(jù)表明，與顆粒啤酒花相比，CO2浸膏的揮發(fā)性成分與其最為接近.結(jié)合表1的數(shù)據(jù)可以看出，盡管兩者在碳?xì)浠衔锏目偤?、醛酮、醇類、酯類化合物等的組成上都非常相似，但碳?xì)浠衔锏慕M成與醛酮、醇類、酯類化合物的含量上還是發(fā)生了一定的變化.以酒花中主要的萜烯類物質(zhì)的含量變化來(lái)看，在CO2浸膏的提取過(guò)程中，分子量相對(duì)較小、低沸點(diǎn)的香葉烯在加工過(guò)程中大量損失，相對(duì)含量從31.33%下降到了14.02%，同樣，進(jìn)一步采用分子蒸餾提取的酒花精油所獲得的數(shù)據(jù)也證實(shí)了這一結(jié)論，其在酒花油中的相對(duì)含量?jī)H為2.0%.而分子量相對(duì)較大、沸點(diǎn)較高的葎草烯和石竹烯，在提取CO2浸膏的過(guò)程中由于損失較小，被進(jìn)一步富集，相對(duì)含量分別從12.31%和9.5%提高到了20.61%和16.13%，但葎草烯與石竹烯的比值基本保持不變，該比值也是評(píng)價(jià)啤酒花香氣的一個(gè)重要指標(biāo).進(jìn)一步的分子蒸餾提取精油過(guò)程中，葎草烯與石竹烯相對(duì)含量也基本保持穩(wěn)定，分別為18.21%和16.52%.對(duì)比顆粒酒花與CO2浸膏的化合物組成顯示，在加工過(guò)程中，顆粒酒花中存在的很多沸點(diǎn)相對(duì)較低的組分，在加工過(guò)程中損失較為明顯，如α-側(cè)柏烯、2-β-蒎烯、α-香葉烯、γ-萜品烯、別羅勒烯、新別羅勒烯、波斯菊萜等成分在CO2浸膏中已經(jīng)無(wú)法檢測(cè)到存在，相應(yīng)的分子蒸餾精油中也沒有檢測(cè)到這些化合物，而在顆粒酒花中相對(duì)含量較低或檢測(cè)不到的一些含氧化合物，如醇類、酯類和萜烯氧化物等的種類和含量都明顯提高，這一方面是由于低沸點(diǎn)組分的損失使得這些化合物在提取物中得以富集，另一方面也是由于加工過(guò)程中部分萜烯類化合物向萜烯醇轉(zhuǎn)化而引起的，如橙花醇，香茅醇等在顆粒酒花中并不存在，而在加工產(chǎn)品中均檢測(cè)到了該組分，CO2浸膏中相對(duì)含量為0.3%，分子蒸餾精油中的相對(duì)含量為0.74%，這些物質(zhì)的產(chǎn)生對(duì)協(xié)調(diào)啤酒產(chǎn)品中的酒花香氣具有非常重要的作用.

水蒸氣蒸餾獲得的啤酒花油無(wú)論是組成成分還是相對(duì)含量上與前三個(gè)樣品均存在較大的差異.由于水蒸氣蒸餾酒花油的過(guò)程中需要在較高的溫度下處理一定的時(shí)間，這一個(gè)過(guò)程中，低沸點(diǎn)的揮發(fā)性成分會(huì)大量損失，碳?xì)漕惢衔锏暮恳严陆档搅?7.86%，而醇、酯和萜烯類氧化物的比例大幅提高，分別達(dá)到了7.5%、11.03%和11.34%，這些成分很多在顆粒酒花中檢測(cè)不到或僅有微量存在.比較水蒸氣蒸餾的酒花油與顆粒酒花的揮發(fā)性成分的數(shù)據(jù)表明，水蒸氣蒸餾酒花油中β-香葉烯含量?jī)H為顆粒酒花中的43%，其它一些在顆粒酒花中含量較高的羅勒烯、蒎烯、萜品烯、1，3，8-對(duì)薄荷三烯、別羅勒烯、檸檬烯等檢測(cè)不到或含量明顯下降，而香葉醇（0.37%）、橙花醇(56%)、萜品烯醇(0.35%)、羅勒醇(0.47%)、香茅醇(0.17%)、芳樟醇(0.66%)、紫蘇醇（0.27%）、金合歡醇杜松醇（0.90%）、桉葉油醇（0.69%）等物質(zhì)從無(wú)到有或者含量明顯提高，都說(shuō)明了在水蒸汽的作用下酒花中的一些萜烯類物質(zhì)發(fā)生了結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或氧化為其醇類[15].

3 結(jié)論

早期研究中人們普遍認(rèn)為，萜烯類物質(zhì)對(duì)啤酒的酒花風(fēng)味發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，親水性較強(qiáng)的萜烯醇類對(duì)啤酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)更為明顯[16].通過(guò)比較馬可波羅啤酒花的顆粒酒花及其深加工產(chǎn)品馬可波羅CO2浸膏、分子蒸餾的酒花精油、水蒸氣蒸餾的酒花精油的揮發(fā)性成分的結(jié)果表明，啤酒花揮發(fā)性成分以萜烯類化合物為主，其中CO2浸膏因加工工藝條件溫和，與顆粒酒花的共有組分?jǐn)?shù)量最多（達(dá)78個(gè)），組成也最為接近，除加工過(guò)程中低分子量的成分香葉烯等部分損失外，樣品中僅有相對(duì)含量約2.5%的其它化合物出現(xiàn)，比較完整的保留了酒花的特征風(fēng)味.而通過(guò)分子蒸餾獲得的啤酒花精油，由于加工過(guò)程溫度也相對(duì)較為溫和，且物料與熱源接觸時(shí)間短，除由于分子蒸餾的工藝特點(diǎn)導(dǎo)致的低沸點(diǎn)物質(zhì)損失和短暫高溫引起的含氧化合物如醇、醛、酮、酯和氧化物的數(shù)量明顯多于CO2浸膏外，保留下來(lái)的組分基本與CO2浸膏中的共有組分含量比例極為接近，不僅萜烯類化合物的總量接近76%，與顆粒酒花相比共有組分的相對(duì)比例也達(dá)到了92%.而水蒸汽蒸餾酒花油由于溫度高，提取時(shí)間長(zhǎng)，已不能完全反映出啤酒花本身的風(fēng)味特征，不僅低沸點(diǎn)的頭香類組分損失較多，共有組分的數(shù)量也較少（僅有56個(gè)），且含量變化也較大，但水蒸氣蒸餾提取啤酒花油的過(guò)程比較接近啤酒釀造的麥汁煮沸過(guò)程，更能反映出在啤酒釀造過(guò)程中啤酒花風(fēng)味成分的轉(zhuǎn)化或氧化轉(zhuǎn)變的途徑.