涂宗財(cái)，包中宇，王 輝，黃小琴，石 燕，常海霞

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330 022）

超聲波對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)及其形成谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性凝膠性質(zhì)的影響

涂宗財(cái)1，2，包中宇1，王 輝1，黃小琴2，石 燕1，常海霞1

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330 022）

為探討超聲波對大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）結(jié)構(gòu)及大豆分離蛋白形成谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TG）改性凝膠的影響，研究了超聲波處理前后大豆分離蛋白平均粒徑、 溶解性、表面疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、微觀結(jié)構(gòu)及凝膠特性的變化規(guī)律。結(jié)果表明：超聲波處理使大豆分離蛋白平均粒徑減小，溶解性增加，表面疏水性增強(qiáng)，α-螺旋含量降低，無規(guī)卷曲含量升高，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角無顯著變化；超聲波處理可以促進(jìn)大豆分離蛋白形成結(jié)構(gòu)均勻、致密的TG改性凝膠，最佳處理時(shí)間為60 min，此時(shí)凝膠強(qiáng)度為146.57 g，提高幅度達(dá)62.12%，持水性為94.27%，提高幅度為3.66%。相關(guān)性分析表明，大豆分離蛋白的溶解性以及其形成TG改性凝膠的凝膠強(qiáng)度、持水性與平均粒徑有顯著的負(fù)相關(guān)性。

超聲波；大豆分離蛋白；結(jié)構(gòu)；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶；凝膠性質(zhì)

大豆分離蛋白是以低溫脫脂大豆粕為原料生產(chǎn)的一種全價(jià)蛋白產(chǎn)品，具有成本低、蛋白含量高等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食品加工中［1-2］。由于商用大豆分離蛋白受堿溶酸沉、噴霧干燥等操作的影響，溶解性較差，功能性質(zhì)不強(qiáng)［3］，極大地限制了其在食品領(lǐng)域中的 應(yīng)用。因此，大豆分離蛋白的改性已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

目前，改善大豆分離蛋白功能性質(zhì)的方法主要包括物理改性、化學(xué)改性和酶法改性［4］。超聲波作為一種新興的技術(shù)，已被應(yīng)用于食品生物大分子的改性研究中。Hu Hao等［5］通過超聲波輔助鈣鹽誘導(dǎo)大豆分離蛋白凝膠。Zhang Qiuting等［6］進(jìn)行了超聲波對花生分離蛋白的改性，研究發(fā)現(xiàn)超聲波可以降低花生分離蛋白的粒度、改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，提高了花生蛋白的溶解性、乳化性等。超聲波技術(shù)由于具有快速高效、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)改性與新產(chǎn)品開發(fā)方面潛力巨大［7］。

凝膠特性是大豆分離蛋白重要的功能性質(zhì)之一， 直接影響著食品的品質(zhì)［8］。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TG）可催化蛋白質(zhì)分子間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)形成凝膠［9］。但由于大豆分離蛋白溶解性較差，易分層，不利于TG促交聯(lián)改性。本實(shí)驗(yàn)擬采用超聲波對大豆分離蛋白進(jìn)行預(yù)處理，分析處理前后大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)的變化，并對處理后大豆分離蛋白形成TG改性凝膠的規(guī)律進(jìn)行研究，試圖改善TG對大豆分離蛋白的改性效果，拓寬超聲波技術(shù)以及大豆分離蛋白的應(yīng)用范圍。

1　材料與方法

1.1材料與 試劑

大豆分離蛋白（蛋白質(zhì)含量≥90%） 谷神生物科技有限公司；TG（酶活力≥90 U/g） 北京鴻潤寶順科技有限公司。

考馬斯亮藍(lán)G250 美國BBI公司；無水乙醇天津市大茂化學(xué)試劑廠；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；戊二醛、叔丁醇 阿拉丁試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

JY98-IIIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股權(quán)股份有限公司；Brookfield CT3質(zhì)構(gòu)分析儀 美國Brookfield公司；UV-3200紫外-可見分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；Nicomp380ZLS粒度儀 美國Nicomp公司；F-7000熒光光譜儀 日本日立公司；FBIQuanta200F環(huán)境掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；MOS-450/AF-CD圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司。

1.3方法

1.3.1樣品的制備

配制5 份質(zhì)量濃度為50 mg/mL的大豆分離蛋白溶液400 mL于500 mL燒杯中，調(diào)pH值至7.0，室溫?cái)嚢柽^夜，進(jìn)行超聲波處理。處理?xiàng)l件：頻率20 kHz，功率400 W，探頭插入液面下1 cm，冰水浴控制溫度為（15±2） ℃，工作時(shí)間為1 s，間歇時(shí)間3 s，處理時(shí)間分別為0、30、60、90、120 min。超聲處理后的樣品經(jīng)冷凍干燥后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2平均粒徑的測定

平均粒徑的測定參照Liu Chengmei等［10］的方法，將1.3.1節(jié)制備的樣品配制成10 mg/mL的水溶液，磁力攪拌2 h，置于4 ℃冰箱中過夜以確保完全溶解。用Nicomp380 ZLS激光納米粒度儀對樣品的平均粒徑進(jìn)行測定，重復(fù)3 次。

1.3.3溶解性的測定

將1.3.1節(jié)制備的樣品配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL溶液，室溫下攪拌2 h后8 000 r/min離心20 min，采用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液中可溶性蛋 白質(zhì)含量［11］。

1.3.4表面疏水性的測定

參照Chan等［12］的方法測定。將1.3.1節(jié)制備的樣品配制成為10 mg/mL溶液，然后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0）將樣品液稀釋1、2、4 倍。取4.0 mL稀釋后的蛋白溶液與16 μL 80 mmol/L ANS磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）混勻，室溫下放置2 min后測定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長371 nm，發(fā)射波長467 nm，掃描速率1 200 nm/min，狹縫寬度5.0 nm。以未加熒光探針的相應(yīng)質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)溶液所測得的熒光強(qiáng)度作為空白。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）對熒光強(qiáng)度作圖，采用線性回歸分析進(jìn)行曲線擬合，直線的斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性。

1.3.5圓二色譜（circular dichroism，CD）分析

采用MOS-450/AF-CD圓二色譜儀測定大豆分離蛋白溶液的近紫外圓二光譜變化。將1.3.1節(jié)制備的樣品配制成質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL蛋白溶液，注入1 mm厚的樣品池，在25 ℃連續(xù)充氮的條件下進(jìn)行近紫外掃描。掃描范圍：190～250 nm；掃描速率：50 nm/min；光譜間隔：1.0 nm。CD數(shù)據(jù)以平均橢圓率表示，采用CD Pro軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

1.3.6凝膠強(qiáng)度的測定［13］

將1.3.1節(jié)制備的樣品配制成質(zhì)量濃度為11 mg/100 mL溶液，加入TG，加酶量均為底物的6%（以干質(zhì)量計(jì)），混勻，水浴50 ℃反應(yīng)3 h，95 ℃滅酶10 min，立即冰浴冷卻，將所得溶液置于4 ℃冰箱24 h后取出放置30 min，最后采用質(zhì)構(gòu)儀測定其凝膠強(qiáng)度。

測定參數(shù)：探頭TA10，測試速率0.8 mm/s，返回速率0.8 mm/s，目標(biāo)深度10 mm。凝膠強(qiáng)度為第1次擠壓變形時(shí)，物體所產(chǎn)生應(yīng)力的最大值。

1.3.7凝膠樣品持水性（water holding capacity，WHC）的測定

測定方法依據(jù)Gu Xin等［14］的方法，略有改動(dòng)，采用1.3.6節(jié)制備的大豆分離蛋白TG改性凝膠在9 000 r/min條件下離心20 min。持水性計(jì)算見下式。

式中：m1為凝膠樣品中所含水分的總質(zhì)量/g；m2為離心后凝膠析出水分的質(zhì)量/g。

1.3.8微觀結(jié)構(gòu)觀察［15］

取待測凝膠樣品，用雙面刀片切成約2 mm×5 mm的薄片，用體積分?jǐn)?shù)為2.5%，pH 7.2的戊二醛，于4 ℃條件下浸泡2.0 h進(jìn)行固定，再用0.1 mol/L，pH 7.2磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，每次10 min。然后用體積分?jǐn)?shù)分別為50%、70%、80%、90%的乙醇進(jìn)行脫水，每次10 min；再用無水乙醇脫水3 次，每次10 min。之后用100%乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V）；純叔丁醇進(jìn)行置換各1 次，每次15 min。用真空冷凍干燥機(jī)對樣品進(jìn)行干燥。采用FEIQuanta200F型環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察凍干樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1超聲波處理對大豆分離蛋白平均粒徑的影響

圖1　超聲波對大豆分離蛋白平均粒徑的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment on particle size of SPI solution

由圖1可知，相對于未處理的大豆分離蛋白，超聲波處理能顯著降低大豆分離蛋白平均粒徑，隨著處理時(shí)間的延長，物料平均粒徑先急劇下降后略有增加，60 min時(shí)達(dá)到最低，為233.60 nm。Arzeni等［16］在研究超聲波處理卵清蛋白時(shí)也發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象?？赡苁怯捎诔暡ǖ目昭ㄐ?yīng)使溶液形成湍流，湍流產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將蛋白顆粒打散［17］。但隨著超聲時(shí)間繼續(xù)增加，平均粒徑反而從233.6 nm上升到244.4 nm，這可能是因?yàn)槌L時(shí)間的高強(qiáng)度處理誘發(fā)了蛋白顆粒因靜電或疏水作用等非共價(jià)作用而形成微小的物理聚集體，致使平均粒徑增大［17］。

2.2超聲波處理對大豆分離蛋白溶解性的影響

圖2　超聲波對大豆分離蛋白溶解性的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment on solubility of SPI

由圖2可知，超聲波處理能顯著提高大豆分離蛋白的溶解性，并隨著處理時(shí)間的延長，蛋白溶解性先增大后略有下降，60 min時(shí)，溶解性達(dá)到最大，為5.12 mg/mL。溶解性的增加一方面是由于在超聲波處理過程中，部分蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，強(qiáng)化了蛋白質(zhì)-水的相互作用，原本不溶性蛋白變成可溶性蛋白，使可溶性蛋白含量增加［18］，另一方面超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)等作用使大顆粒的蛋白聚集體解聚成較小顆粒的蛋白分子，蛋白質(zhì)顆粒體積的減小，增強(qiáng)了在水中可壓縮性，從而使蛋白質(zhì)更易分散在水中［19-20］。

2.3超聲波處理對大豆分離蛋白表面疏水性的影響

圖3　超聲波對大豆分離蛋白表面疏水性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment on surface hydrophobicity of SPI

疏水作用不僅在研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象和分子間相互作用中具有重要作用［12］，而且在凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成中也起到一定的作用［21］。由圖3可知，超聲波處理后，大豆分離蛋白的表面疏水性增強(qiáng)，且隨超聲時(shí)間的增加，表面疏水指數(shù)呈先升高后降低的趨勢，在60 min時(shí)達(dá)到最大值，為1 342.20，可能的原因是超聲處理破壞了蛋白原有的有序結(jié)構(gòu)，使部分原先包埋在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，從而使表面疏水性增加［22］。當(dāng)處理時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，由于蛋白顆粒之間靜電等非共價(jià)作用發(fā)生聚集，部分疏水基團(tuán)又重新被包埋。

2.4超聲波處理對大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

表1　超聲波處理后大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化Table 1 Change in the secondary structure of SPI by ultrasonic treatment

蛋白質(zhì)分子內(nèi)多肽鏈可形成α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等特定的立體結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)的變化可反映蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。由表1可知，經(jīng)超聲波處理后，大豆分離蛋白的α-螺旋含量顯著降低，無規(guī)卷曲含量顯著升高，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量未發(fā)生顯著性變化。說明大豆分離蛋白分子剛性結(jié)構(gòu)減弱，柔性結(jié)構(gòu)增加，分子由有序變得無序?？赡艿脑蚴堑鞍椎亩?jí)結(jié)構(gòu)主要由肽鏈氨基酸上羰基和酰胺基團(tuán)之間形成的氫鍵維持，超聲波處理能夠破壞氫鍵作用，使蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞。Chandrapala［23］、Gülse ren［24］等的研究也發(fā)現(xiàn)超聲波處理能引起蛋白的α-螺旋、β-折疊或無規(guī)卷曲等含量的變化。因此，超聲波處理能夠破壞大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.5超聲波處理對大豆分離蛋白形成TG改性凝膠的影響

圖4　超聲波對大豆分離蛋白形成TG改性凝膠強(qiáng)度及持水性的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment on water-holding capacity （WHC）and gel strength of TG-induced SPI gels

經(jīng)超聲波處理后，大豆分離蛋白溶液在TG的作用下形成凝膠，處理不同時(shí)間的大豆分離蛋白形成TG改性凝膠的 凝膠強(qiáng)度及持水性不同。由圖4可知，在TG用量相同的情況下，經(jīng)超聲波處理后，形成的大豆分離蛋白TG改性凝膠強(qiáng)度均有提高，且隨超聲時(shí)間的增加，樣品的凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在60 min時(shí)達(dá)到最大值146.57 g，相對于未處理的樣品提高了62.12%。說明超聲處理后的大豆分離蛋白更有利于TG進(jìn)行改性形成凝膠。這可能是因?yàn)槌暡ㄌ幚硎沟鞍最w粒變小，表面積增大，部分二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，分子展開，TG作用位點(diǎn)增加，更利于TG對大豆分離蛋白進(jìn)行酶促交聯(lián)改性，從而凝膠強(qiáng)度增加［13，25］。同時(shí)2.3節(jié)的結(jié)果表明，經(jīng)超聲處理后蛋白表面疏水基團(tuán)增 加，也有利于凝膠的形成。

持水性結(jié)果表明，超聲處理能提高大豆分離蛋白TG改性凝膠的持水性，但增加的效果不明顯，最大提高幅度僅為3.66%。

2.6微觀結(jié)構(gòu)分析

圖5　超聲波對大豆分離蛋白及其TG改性凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of ultrasonic treatment on surface microstructure of SPI and TG-induced SPI gels

大豆分離蛋白凝膠性質(zhì)與其微觀結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。由圖5可知，未經(jīng)超聲處理的大豆分離蛋白形成的TG改性凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較為疏松，有較大且排列不規(guī)則的孔洞，經(jīng)超聲處理后形成的TG改性凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均勻、致密，孔洞較小。但隨著處理時(shí)間的延長孔洞有所增大。在宏觀上體現(xiàn)為凝膠強(qiáng)度和持水性的提高或降低。這與前面的研究是一致的。

2.7相關(guān)性分析

表2　平均粒徑與溶解性、凝膠強(qiáng)度、持水性的相關(guān)性分析Table 2 Correlations analysis of particle size with solubility， gel strength and WHC

由表2可知，大豆分離蛋白平均粒徑與溶解性、凝膠強(qiáng)度、持水性的相關(guān)系數(shù)分別為－0.922、－0.930、－0.913，表明平均粒徑與溶解性、凝膠強(qiáng)度、持水性具有顯著的負(fù)相關(guān)性。這項(xiàng)研究結(jié)果與前期報(bào)道一致［25］。由于超聲波處理可以有效降低大豆分離蛋白的平均粒徑，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，使其溶解性增加，促進(jìn)了大豆分離蛋白形成TG改性凝膠。

3　結(jié) 論

短時(shí)間的超聲波處理能夠顯著降低大豆分離蛋白的平均粒徑，使大豆分離蛋白溶解性增加，但延長超聲時(shí)間又會(huì)引起蛋白聚集，這是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程。熒光光譜及圓二分析表明超聲波處理能夠引起部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

超聲波處理可以促進(jìn)大豆分離蛋白形成TG改性凝膠，這是由于超聲波處理使蛋白顆粒變小，溶解性增加，結(jié)構(gòu)展開，構(gòu)象改變，增加了酶與底物結(jié)合機(jī)率，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)，從而形成均勻致密的的凝膠網(wǎng)絡(luò)，使凝膠強(qiáng)度和持水性增加。

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Effect of Ultrasonic Treatment on Structure and Gel Properties Induced by Transglutaminase of Soybean Protein Isolate

TU Zongcai1，2， BAO Zhongyu1， WANG Hui1， HUANG Xiaoqin2， SHI Yan1， CHANG Haixia1
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang 330047， China；2. College of Life Science， Jiangxi Normal University， Nanchang 330022， China）

To study the effect of ultra sonic trea tment on structure and gel properties induced by transglutaminase （TG）of soybean protein isolate （SPI）， the change in particle size， solubility， surface hydrophobicity， secondary structure，microstructure and gel properties of ultrasonicated SPI was measured in comparison to the untreated one. Results indicated that ultrasonic pretreatment could reduce particle size and increase solubility and surface hydrophobicity as well as random coil content of SPI. Ultrasonic pretreatment could decrease α-helix content without causing any significant changes in the contents of β-sheet and β-turn. SPI gels induced by TG could be promoted by ultrasonic treatment， and the gel had denser and more uniform microstructure when compared with the untreated gel. When treated for 60 min， the gel strength and waterholding capacity were 146.57 g and 94.27%， respectively， showing an increase by 62.12% and 3.66%， respectively. Correlation analysis showed that the particle size of SPI dispersion was negatively correlated with solubility， gel strength and WHC.

ultrasonic； soybean protein isolate （SPI）； structure； transglutaminase （TG）； gel property

TS214.2

A

1002-6630（2015）15-0015-05

10.7506/spkx1002-6630-201515004

2014-06-30

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2012CB126314）；江西省重大科技創(chuàng)新項(xiàng)目（20124ACB00600）

涂宗財(cái)（1965—），男，教授，博士，主要從事極端條件下食品蛋白質(zhì)營養(yǎng)與安全研究。E-mail：tuzc-mail@aliyun.com