陳佳等

摘 要 基于G-四鏈體/血紅素 DNA酶的高催化活性以及λ核酸外切酶（λexo）的輔助放大功能，以17個(gè)堿基的DNA片段作為模型分析物，構(gòu)建了一種快速、靈敏、特異性好的新型Luminol-H2O2-G-四鏈體/血紅素 DNA酶化學(xué)發(fā)光傳感體系?？疾炝甩薳xo用量、Luminol濃度、H2O2濃度、溶液pH值對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，即：pH=9.0，10 units λexo， 1.0×103 mol/L Luminol，3.0 × 102 mol/L H2O2，測(cè)得DNA在2.0×1012～8.0×109 mol/L的濃度范圍內(nèi)與Luminol的相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度之間呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，檢出限（3σ）為0.7×1013 mol/L。本方法可以區(qū)分不同錯(cuò)配的核酸序列，并可用于復(fù)雜生物樣品的分析。

關(guān)鍵詞 λ核酸外切酶；G-四鏈體/血紅素DNA酶；化學(xué)發(fā)光；DNA

1 引 言

DNA是生物體遺傳信息的載體[1]，構(gòu)建快速、靈敏、高選擇性的生物分析新方法用于低豐度的DNA序列的檢測(cè)在臨床診斷、基因篩選、食品和環(huán)境監(jiān)測(cè)、國(guó)土安全等方面起著至關(guān)重要的作用[2，3]。近年來(lái)，信號(hào)放大已經(jīng)成為提高DNA檢測(cè)靈敏度的重要手段，如采用納米材料作為信號(hào)放大的標(biāo)記物、采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）或者滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）等核酸擴(kuò)增技術(shù)等。雖然這些方法大大提高了檢測(cè)的靈敏度，但是也存在操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、價(jià)格昂貴、易出現(xiàn)假陽(yáng)性信號(hào)等缺陷[4，5]。使用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行信號(hào)放大的方法，較以往的信號(hào)放大方法更為簡(jiǎn)單、快速，但是由于限制性?xún)?nèi)切酶只能針對(duì)特定的DNA序列，在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性[6，7]。因此，發(fā)展快速、靈敏的DNA測(cè)定新方法具有重要的理論和實(shí)際意義[8]。

λ核酸外切酶（Lambda exonuclease，λexo）是一種高持續(xù)性核酸外切酶，能夠催化雙鏈DNA分子自5′磷酸末端→3′方向逐步水解，并釋放出5′-單核苷酸，進(jìn)而將雙鏈DNA變成單鏈DNA[9，10]。λexo在核酸重組、復(fù)制、分型、基因修復(fù)以及分子克隆等方面起著至關(guān)重要的作用，已成為研究基因組成、功能及表達(dá)的重要工具之一。此外，許多研究者將λexo的獨(dú)特性質(zhì)應(yīng)用于核酸探針的信號(hào)放大技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)核酸、蛋白質(zhì)等生物分子的超靈敏檢測(cè)[11～14]。但是這些方法大多需要對(duì)核酸探針進(jìn)行熒光標(biāo)記，過(guò)程復(fù)雜且成本較高。

G-四鏈體/血紅素 DNA酶（G-Quadruplexes/hemin DNAzyme）是一種具有催化性能的人工模擬酶，由富含鳥(niǎo)嘌呤堿基的核酸分子與血紅素結(jié)合，形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出類(lèi)似于辣根過(guò)氧化物酶的活性，能夠催化H2O2氧化2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）產(chǎn)生顏色變化或者催化H2O2氧化魯米諾（Luminol）產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光[15～17]，在生化分析領(lǐng)域已經(jīng)引起研究者的廣泛關(guān)注[18]。

化學(xué)發(fā)光（Chemiluminescence， CL）分析由于不需要激發(fā)光源，避免了背景光和雜散光的干擾，大大提高了信噪比，具有靈敏度高、線(xiàn)性范圍寬、分析速度快、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于免疫分析、臨床檢驗(yàn)、環(huán)境檢測(cè)、物質(zhì)分析等領(lǐng)域[19～22]。本研究采用3條核酸鏈構(gòu)建DNA夾心結(jié)構(gòu)，使用λexo進(jìn)行目標(biāo)DNA的輔助放大，建立了新型化學(xué)發(fā)光傳感器，成功實(shí)現(xiàn)了DNA檢測(cè)。本方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢(shì)，可用于實(shí)際樣品分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

LS-55型發(fā)光光度計(jì)（美國(guó)Perkin-Elmer公司）；PHSJ-4A型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

所有DNA片段均由上海生工生物有限公司提供（序列見(jiàn)表1）。Luminol、H2O2（國(guó)藥上海試劑公司）；血紅素（Hemin）、N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；λ核酸外切酶（Lambda exonuclease，λexo）、10×λexo反應(yīng)緩沖液（0.67 mol/L Glycine-KOH（pH 9.4，25℃），0.02 mol/L MgCl2，500 μg/mL BSA）購(gòu)于美國(guó)New England Biolabs公司。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為18.2 MΩ·cm的超純水。2.5 × 102 mol/L HEPES-NH4OH緩沖液（pH=7.4/8.0/8.5/9.0/9.5/10.0），含0.05%（w/V）Triton X-100，1%（V/V）DMSO，2.0×102 mol/L KCl和0.2 mol/L NaCl。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 DNA的檢測(cè) 將濃度均為1.0×105 mol/L的Auxiliary DNA、Phosphate-DNA、Hairpin DNA溶液以及不同濃度的Target DNA在95℃下加熱10 min，再自然冷卻到室溫。

取出20 μL不同濃度的Target DNA與10 μL Auxiliary DNA、10 μL Phosphate-DNA，在37℃雜交2 h；雜交完成后，加入5 μL λexo （2 U/μL）及5 μL 10 × λexo反應(yīng)緩沖液，在37℃下溫育30 min。隨后，將上述混合溶液加熱到75℃，保持10 min，再冷卻至37℃，孵育1 h；加入10 μL Hairpin DNA，在37℃孵育30 min，再向上述混合溶液中加入20 μL Hemin（終濃度為2.0×107 mol/L）及820 μL HEPES-NH4OH緩沖溶液，充分混勻后，在室溫下孵育1 h，保證Hemin與打開(kāi)的Hhairpin DNA充分反應(yīng)，形成穩(wěn)定的G-Quadruplexes/hemin DNAzyme結(jié)構(gòu)。最后，依次將50 μL Luminol（終濃度為1.0×103 mol/L）、50 μL H2O2（終濃度為3.0×102 mol/L）加入到上述溶液中，在室溫下立即測(cè)量樣品的CL光譜。

2.2.2 化學(xué)發(fā)光測(cè)定

CL測(cè)量均使用光程為1 cm的比色池。電壓設(shè)置為800 V，狹縫寬度設(shè)為15 nm，掃描速度為1200 nm/min，測(cè)量時(shí)關(guān)掉LS-55型發(fā)光光度計(jì)的氙燈，測(cè)定樣品溶液在425 nm處的相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度ΔI（ΔI=I-I0， I0為無(wú)Target DNA存在時(shí)Luminol的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度， I為不同濃度的Target DNA存在時(shí)Luminol的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度）。每個(gè)樣品均平行測(cè)定3次。

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示，本體系包括4種DNA：Target DNA、Phosphate-DNA、Auxiliary DNA、Hairpin DNA。首先，Phosphate-DNA與AuxiliaryDNA及Target DNA進(jìn)行雜交，形成DNA的復(fù)合結(jié)構(gòu)。隨后向溶液中加入λexo，由于λexo可作用于5′磷酸化的雙鏈DNA分子，并沿5′-3′方向漸進(jìn)性催化去除5′單核苷酸，破壞雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，同時(shí)釋放出Auxiliary DNA及Target DNA。釋放出的Target DNA可以繼續(xù)進(jìn)入下一輪循環(huán)，不斷產(chǎn)生大量Auxiliary DNA，而Auxiliary DNA可以將Hairpin DNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，打開(kāi)的Hairpin DNA在血紅素存在的條件下，可以形成穩(wěn)定的G-Quadruplexes/HeminDNAzyme結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出類(lèi)似于過(guò)氧化物酶的活性，能夠催化H2O2氧化Luminol產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，并且Luminol產(chǎn)生的相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與目標(biāo)DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成比例，從而可以實(shí)現(xiàn)Target DNA的定量分析檢測(cè)。

3.2 可行性研究

不同條件下的化學(xué)發(fā)光光譜（圖2） 表明，單獨(dú)的Hemin化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度十分微弱（曲線(xiàn)a）；不加入Target DNA（曲線(xiàn)b）， 或者不加入λexo（曲線(xiàn)c）的情況下，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度也較弱； 圖2 不同體系的化學(xué)發(fā)光光譜

Fig.2 CL spectra of hemin （a）， phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/λexo/hemin （b）， phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/target DNA/hemin （c） and phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/target DNA/λexo/hemin （d and e）. Experimental conditions： 1.0×107 mol/L phosphate-DNA， 1.0×107 mol/L auxiliary DNA， 1.0×107 mol/L hairpin DNA， 5.0×1012 mol/L target DNA（curve d） and 8.0×109 mol/L target DNA（curve c and e）， 2.0×107 mol/L hemin， 10 units lambda exonuclease （λexo）， 1.0×103 mol/L Luminol， 3.0×102 mol/L H2O2加入λexo及Target DNA后，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加，且Target DNA濃度越高，發(fā)光強(qiáng)度越高（曲線(xiàn)d和e）?；瘜W(xué)發(fā)光強(qiáng)度的增加是由于λexo催化水解磷酸化5′末端，釋放Target DNA，并不斷進(jìn)入下一循環(huán)，產(chǎn)生大量的Auxiliary DNA，可以與Hairpin DNA形成大量的G-Quadruplexes/hemin DNAzyme結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果表明，本方法可用于Target DNA檢測(cè)。

3.3 測(cè)定條件的優(yōu)化

3.3.1 λexo用量對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響 由于λexo用量直接影響目標(biāo)DNA的循環(huán)效果，進(jìn)而影響檢測(cè)體系的化學(xué)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)弱，因此實(shí)驗(yàn)首先考察了λexo用量對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響（圖3），結(jié)果表明，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著λexo用量的增加而逐漸增強(qiáng)，并且當(dāng)λexo的用量達(dá)到10 units 時(shí)，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。因此，實(shí)驗(yàn)將λexo的最佳用量定為10 units。

3.3.2 pH值對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響 由于體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與緩沖介質(zhì)的pH值之間存在一定關(guān)系[6，16]，因此考察了不同pH條件對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，所用HEPES-NH4OH緩沖溶液使體系pH值從7.4逐漸增加到9.0時(shí)，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且在pH=9.0時(shí)達(dá)到最大值；之后繼續(xù)增大pH值，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸減弱。最終選擇pH=9.0的HEPES-NH4OH緩沖溶液作為最佳緩沖條件。

3.3.3 Luminol濃度對(duì)體系發(fā)光強(qiáng)度的影響 作為化學(xué)發(fā)光的底物，Luminol的濃度強(qiáng)烈影響體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。本研究考察了不同濃度的Luminol對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。在0.4～1.0 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，隨著Luminol濃度的增加，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且在Luminol濃度為1.0×103 mol/L時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大值；之后繼續(xù)增大Luminol的濃度，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此選擇Luminol的最佳濃度為1.0 mmol/L。

3.3.4 H2O2濃度對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響 考察了化學(xué)發(fā)光的氧化試劑H2O2的濃度對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響示。從圖6可見(jiàn)，H2O2濃度在5.0～30 mmol/L范圍內(nèi)，隨著H2O2濃度增加，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；當(dāng)H2O2濃度在30～50 mmol/L時(shí)，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸減弱。為了獲得較大的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)選擇H2O2的最佳濃度為30 mmol/L。

3.4 靈敏度的考察

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定目標(biāo) DNA濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度之間的關(guān)系（圖7和圖8）。從圖7可見(jiàn)， Luminol的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著目標(biāo)DNA濃度的增加而不斷增強(qiáng)，并且Luminol的相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度ΔI與目標(biāo)DNA在2.0×1012～8.0×109 mol/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系（圖8），檢出限為0.7×1013 mol/L（3σ）。與文獻(xiàn)報(bào)道的方法比較（表2）可見(jiàn)，本方法的靈敏度優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的光學(xué)檢測(cè)方法， 或與之相當(dāng)。

3.5 特異性的考察

為考察所建立方法的特異性，選擇濃度均為8.0×108 mol/L的隨機(jī)序列DNA片段、單堿基錯(cuò)配的DNA片段， 以及三堿基錯(cuò)配的DNA片段作為對(duì)照樣品，與8.0×109 mol/L目標(biāo)DNA進(jìn)行分析比較。從圖9可見(jiàn)，僅有完全互補(bǔ)的目標(biāo)DNA存在時(shí)，才能使體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度顯著增加；相比之下，其它幾種DNA的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度很低。結(jié)果表明，構(gòu)建的化學(xué)發(fā)光傳感器具有很好的特異性，可以區(qū)分不同錯(cuò)配的DNA序列。

3.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

為了考察所建立的方法檢測(cè)復(fù)雜生物樣品的可行性，進(jìn)行了人血清樣品中的標(biāo)準(zhǔn)添加實(shí)驗(yàn)。人血清樣品稀釋100倍進(jìn)行加標(biāo)分析。從圖10可見(jiàn)，目標(biāo)DNA在人血清樣品中的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與其在緩沖溶液中的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值基本一致，表明通過(guò)樣品稀釋可以有效降低復(fù)雜樣品的基質(zhì)的影響。結(jié)果表明，本方法在復(fù)雜生物樣品的分析方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)展了一種基于λexo輔助放大和G-Quadruplexes/hemin DNAzyme催化放大的簡(jiǎn)單、快速的傳感新方法，成功實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)DNA在緩沖溶液和復(fù)雜生物樣品中的高靈敏檢測(cè)。本方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：與傳統(tǒng)的光學(xué)分析方法相比，本方法不需要標(biāo)記任何發(fā)光基團(tuán)，分析成本低；整個(gè)檢測(cè)過(guò)程都是在均相溶液中進(jìn)行，無(wú)需經(jīng)過(guò)洗滌、分離等繁瑣的操作步驟，簡(jiǎn)單方便；本方法具有很高的靈敏度和特異性；本方法對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)具有良好的通用性，通過(guò)改變Phosphate-DNA的堿基序列很容易應(yīng)用于其它目標(biāo)DNA的檢測(cè)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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