雷雯等

摘 要 以硅烷化試劑N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA）對(duì)氨基酸加以衍生，建立了衍生化15N標(biāo)記丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和尿素同位素豐度的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，5種衍生化物均得到基線分離。通過對(duì)5種衍生化物的EI質(zhì)譜圖進(jìn)行解析，選擇合適的特征碎片離子作為同位素豐度的計(jì)算依據(jù)，并采用同位素峰簇算法計(jì)算同位素豐度，實(shí)現(xiàn)了多種化合物同位素豐度同時(shí)測定。以高豐度15N標(biāo)記氨基酸和尿素對(duì)照品對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，方法的精密度優(yōu)于0.15%，同位素豐度相對(duì)偏差小于1.4%。本方法已成功用于測定動(dòng)物血液中15N標(biāo)記的4種氨基酸和尿素的同位素豐度。

關(guān)鍵詞 同位素豐度； 氨基酸； 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用； 氮同位素標(biāo)記

1 引 言

在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸常作為示蹤劑對(duì)生物體的新陳代謝[1]進(jìn)行表達(dá)或用于蛋白質(zhì)合成率[2]的測定，同時(shí)也被用于蛋白質(zhì)定量組學(xué)[3]。通過將標(biāo)記的氨基酸如甘氨酸-15N、丙氨酸-15N、谷氨酸-15N等經(jīng)靜脈注射入生物體內(nèi)，通過測定血液、尿液或組織樣品中同位素豐度則可計(jì)算出蛋白質(zhì)的更新率、合成率和分解率等，而尿素是代謝過程中的最終產(chǎn)物，因而監(jiān)測尿素-15N2的同位素豐度也可提供相應(yīng)的代謝信息?！禖ell》雜志近期報(bào)道了以同位素標(biāo)記的谷氨酰胺和葡萄糖作為示蹤劑，得到在MYC癌基因表達(dá)及缺氧的條件下細(xì)胞中谷氨酰胺的代謝情況，從而指導(dǎo)癌癥疾病的靶向治療的研究[4]。血液或組織液中標(biāo)記氨基酸同位素豐度的準(zhǔn)確測定直接影響到了代謝過程的精準(zhǔn)表達(dá)。氣體同位素質(zhì)譜法可用于化學(xué)純度較高的單一氨基酸同位素豐度的測定[5]。而實(shí)際血液或組織液樣品中基質(zhì)較為復(fù)雜，氨基酸含量較低[6～8]，其同位素豐度的檢測則是難點(diǎn)所在。Nakamura等[9]使用LC-MS/MS分析了老鼠血漿氮代謝循環(huán)中多種氨基酸15N與14N的同位素豐度比（（M+1）/M），從而反應(yīng)出15N在老鼠不同部位的富集情況。江驥等[10]采用衍生化-氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用法測定了血漿中15N標(biāo)記甘氨酸的同位素豐度。在13C代謝流分析中，有報(bào)道使用GC-MS測定了大腸桿菌、酵母等微生物中或菌體蛋白中13C標(biāo)記氨基酸同位素豐度[11，12]。目前還未有GC-MS同時(shí)測定血漿或組織液中15N標(biāo)記多種氨基酸同位素豐度的報(bào)道。本研究采用GC-MS法研究血液中15N標(biāo)記丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和尿素的同位素豐度同時(shí)測定的方法，首先在優(yōu)化的GC-MS條件下對(duì)上述5種化合物進(jìn)行分離，分析每種氨基酸衍生物在EI譜圖的碎裂規(guī)律，找出適用于15N同位素豐度計(jì)算的碎片離子，建立同位素豐度計(jì)算方法； 進(jìn)而對(duì)高豐度氨基酸和尿素對(duì)照品進(jìn)行測定， 以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性； 最后對(duì)實(shí)際血液樣品進(jìn)行分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS/MS，7890B-7000C，美國Agilent公司）； HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm， 美國Agilent公司）； 超純水系統(tǒng)（美國Merck Millipore Simplicity公司）； 低溫高速離心機(jī)（韓國Heraeus）； 電子天平（美國Ohaus，精度0.01 mg），氮吹儀（上海安譜科技有限公司）。

硅烷化試劑N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA， 美國RegisTechnologies公司）； 天然豐度氨基酸對(duì)照品丙氨酸（純度98.5%）、甘氨酸（純度99%）、谷氨酸（純度98.5%）、天冬氨酸（純度98.5%）均購于上?；菖d生化試劑有限公司； 尿素（純度98.5%，美國USP公司）； 穩(wěn)定同位素15N標(biāo)記丙氨酸（純度98%，豐度98.52%），甘氨酸（純度98%，豐度98.10%），谷氨酸（純度98%，豐度98.11%），天冬氨酸（純度98%，豐度98.07%），尿素-15N2（純度99%，豐度98.14%）均為上海化工研究院同位素所研制產(chǎn)品，同位素豐度由氣體同位素質(zhì)譜儀測定，作為高豐度對(duì)照品使用； 動(dòng)物血液樣品（羊血液，西南大學(xué)提供），甲酸（HPLC級(jí)，CNW公司）； 乙腈（LC-MS級(jí)，Scharlab公司）； 吡啶和甲氧胺（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品制備 天然豐度對(duì)照品：分別稱取1.0 mg甘氨酸、1.2 mg丙氨酸、1.8 mg天冬氨酸、2.0 mg谷氨酸、1 mg尿素于1.5 mL氣相進(jìn)樣瓶。40℃下真空干燥2 h，加入2%甲氧胺吡啶溶液600 μL，充分溶解混合后，放入烘箱37℃下預(yù)混合1 h。加入600 μL MSTFA，60℃下反應(yīng)2 h，待GC-MS分析。高豐度對(duì)照品的處理方法同天然豐度對(duì)照品。

血液實(shí)際樣品：取待測血樣1 mL，加入9 mL丙酮于25 mL離心管中充分混合，在4000 r/min下離心10 min，然后取上清液，氮吹至干燥，加入2%甲氧胺吡啶溶液300 μL，充分溶解混合后，放入烘箱37℃下預(yù)混合1 h。加入300 μL MSTFA，60℃下反應(yīng)2 h，經(jīng)0.22 μm濾頭過濾后待GC-MS分析。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)條件 色譜條件：色譜柱：Agilent HP-5 MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）； 載氣He（99.999%），流速1.0 mL/min； 進(jìn)樣口溫度290℃； 升溫程序：初始100℃， 以40℃/min升溫至160℃，再以10℃/min升溫至250℃，最后以20℃/min升溫至300℃； 進(jìn)樣量1.0 μL，分流比50∶1。

GC-MS質(zhì)譜分析條件：電子轟擊離子源（EI），電離能量70 eV； 全掃描（Scan）模式，掃描范圍m/z 50～400； 離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，接口溫度300℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 GC-MS圖譜分析

對(duì)氣相色譜升溫程序進(jìn)行了優(yōu)化，在優(yōu)化的色譜條件下，按照出峰順序，天然豐度丙氨酸、尿素、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸均基線分離，且峰型良好，總離子流圖（TIC）如圖1a所示。高豐度對(duì)照品與天然豐度對(duì)照品保留時(shí)間一致，如圖1b所示。

3.2 衍生化氨基酸特征離子解析

通過對(duì)GC-MS的TIC圖進(jìn)一步解析，可以得到每種氨基酸的EI質(zhì)譜圖。氨基酸在與MSTFA衍生化試劑反應(yīng)后，其結(jié)構(gòu)和分子量均發(fā)生了變化。以丙氨酸為例，氨基端的和羧基端的氫原子分別與硅烷化試劑反應(yīng)，相對(duì)分子量由89變?yōu)?33，如圖2所示。其余氨基酸的反應(yīng)機(jī)理與甘氨酸相似，尿素則為兩個(gè)氨基酸的氫與硅烷化試劑反應(yīng)，反應(yīng)后各物質(zhì)的相對(duì)分子量列于表1。

在上述物質(zhì)衍生物的EI譜圖中，分子離子峰幾乎完全碎裂為碎片離子，對(duì)于15N同位素豐度的計(jì)算，需要選擇帶有N原子的碎片離子進(jìn)行計(jì)算，并且為了減小誤差，該碎片離子最好為基峰或者具有較高的峰強(qiáng)度。以丙氨酸為例，天然豐度標(biāo)準(zhǔn)品的EI質(zhì)譜圖如圖3a所示。丙氨酸衍生物的分子離子峰完全碎裂為碎片離子，其中m/z 116的碎片離子結(jié)構(gòu)如圖4中方框中所示，其中N原子為標(biāo)記位點(diǎn)（圖中*為15N標(biāo)記位點(diǎn)），因此該碎片離子可用于同位素豐度計(jì)算。由圖3b可見，高豐度丙氨酸的特征離子為m/z 117，與圖4中標(biāo)記位點(diǎn)相符。尿素、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的特征離子選擇原則與甘氨酸類似，特征離子的碎裂情況和相對(duì)分子量均列于表1。

3.3 同位素豐度計(jì)算

以丙氨酸衍生物為例，天然豐度的特征離子m/z 116具有天然的同位素分布，包括m/z 116，117和118的同位素峰簇，其天然的同位素豐度比為100∶12.8∶4.5，歸一化之后為0.852∶0.109∶0.038。相應(yīng)的，15N標(biāo)記的特征離子所對(duì)應(yīng)的峰為m/z 117，其同位素峰簇為m/z 117，118和119，如表2所示。然而，在實(shí)際樣品中可能會(huì)出現(xiàn)不完全標(biāo)記的情況，質(zhì)譜圖中同時(shí)存在C5H1414NSi +·和C5H1415NSi +·兩種離子，定義以上兩種離子的摩爾分?jǐn)?shù)分別為X0和X1，二者相對(duì)分子質(zhì)量差1 dalton，這兩種離子均具有一致的同位素分布，即同位素峰簇的峰強(qiáng)比一致，定義A0i和A1i分別為X0和X1在m/z=i時(shí)的峰強(qiáng)，從而得出式（1）。在實(shí)測質(zhì)譜圖中m/z 60 ～ 63范圍內(nèi)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度為兩種離子同位素峰簇的疊加，定義Amixi為實(shí)測質(zhì)譜圖在m/z=i時(shí)的峰強(qiáng)，則有式（2）～（5）。

同時(shí)，各類離子摩爾分?jǐn)?shù)之和應(yīng)該為1，因此x0 +x1=1。由于方程個(gè)數(shù)大于未知數(shù)，因此使用式（1）～（3）即可求解，通過聯(lián)立解方程組，求得兩種離子的摩爾分?jǐn)?shù)。進(jìn)而，由式（6）求得丙氨酸的15N同位素豐度。由于氨基酸的標(biāo)記個(gè)數(shù)為1個(gè)，因此所得到分子百分比等于氨基酸的原子百分比。

使用相同的方法，結(jié)合表1中的特征離子和表3中的天然同位素分布，可對(duì)甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果列于表3。由于15N標(biāo)記的尿素有兩個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，因此在實(shí)際樣品中會(huì)出現(xiàn)C6H17OSi214N14N+·，C6H17OSi214N15N+·和C6H17OSi215N15N+·這種情況，需要定義這3種離子為x0，x1和x2，相似的方法聯(lián)立方程組求得3種離子的分子百分比。由于尿素-15N2的標(biāo)記個(gè)數(shù)為2個(gè)，其15N 原子百分比與分子百分比不同，需要使用式（6）求解，計(jì)算結(jié)果列于表3。由于天然豐度分布的基準(zhǔn)同樣為衍生化后的特征離子，因此衍生化試劑所引入同位素豐度變化可以在計(jì)算過程中被抵消，所得到衍生化氨基酸的同位素豐度值即為目標(biāo)氨基酸的同位素豐度。

由表3可見，方法精密度良好，符合檢測要求。其中，4種氨基酸的精密度均小于0.1%，1： Alanine， 2： Urea， 3： Glycine， 4： Aspartic acid， 5： Glutamic acid.尿素為0.1%。上述5種高豐度化合物由同位素質(zhì)譜儀測定的同位素豐度對(duì)照值同樣列于表3，計(jì)算值與對(duì)照值基本符合，相對(duì)偏差均小于1.4%。

因此，所發(fā)展的同位素豐度計(jì)算方法可以滿足測定需求。

3.4 實(shí)際血液樣品的檢測

對(duì)血液樣品進(jìn)行前處理，使用方法進(jìn)行分析，GC-MS離子流圖如圖5所示，圖中可以識(shí)別40余個(gè)峰，其中種目標(biāo)化合物均被檢出。丙氨酸、尿素、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸衍生物的EI質(zhì)譜圖如圖6所示，每種化合物的保留時(shí)間與天然豐度對(duì)照品一一對(duì)應(yīng)（圖1a），特征離子與表1一致。通過質(zhì)譜圖（圖6）中特征離子峰簇，計(jì)算得出同位素豐度值列于表4。因此，所發(fā)展的方法可以成功測定血液中氨基酸和尿素的同位素豐度值。

4 結(jié) 論

建立了衍生化-氣質(zhì)聯(lián)用測定血液中丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和尿素同位素豐度的方法。對(duì)衍生化的氨基酸和尿素的EI質(zhì)譜圖進(jìn)行解析，選擇了包含同位素標(biāo)記位點(diǎn)且峰強(qiáng)度較高的碎片離子作為同位素豐度的計(jì)算依據(jù)，使用同位素峰簇算法對(duì)同位素豐度進(jìn)行計(jì)算。使用高豐度的氨基酸和尿素對(duì)照品對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，方法的精密度優(yōu)于0.15%，同位素豐度相對(duì)偏差小于1.4%。方法還可以擴(kuò)展至生物體組織、尿液等實(shí)際樣品中氨基酸或尿素的同位素豐度檢測。

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