吳嬈等

摘 要 基于新型富集材料磁性羧基化多壁碳納米管與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，建立了紫蘇籽油中11種酚類化合物同時(shí)分離與檢測(cè)的方法。對(duì)影響富集分離效果的重要因素，如流動(dòng)相、流動(dòng)相中酸的添加量、流速、進(jìn)樣量及碰撞能量等條件進(jìn)行了詳細(xì)優(yōu)化。在優(yōu)化條件下，11種酚類化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.993～0.999，檢出限（LOD， S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分別在0.02～0.70 ng/mL，0.06～2.0 ng/mL范圍內(nèi)，以50和500 ng/mL添加濃度水平進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，回收率為79.6%～121.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06%～13.2%。將本方法應(yīng)用于紫蘇籽油樣品的分析，其含量在7.32～68.6 ng/g之間。結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠，適用于紫蘇籽油等植物油中酚類化合物定量分析。

關(guān)鍵詞 紫蘇籽油； 酚類化合物； 磁固相萃取法； 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

1 引 言

紫蘇（Perillafrutescen（L）Brit.）又名赤蘇、香蘇等，為唇形科一年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用植物。紫蘇籽油是由紫蘇籽經(jīng)烘焙、壓榨和精煉獲得食用油[1]，具有防止動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂、抗氧化、抗衰老、抑菌、抗腫瘤、平喘等作用[2～7]。然而，其作用的分子機(jī)理尚不清楚[7]。目前紫蘇籽油化學(xué)成分認(rèn)識(shí)僅限于脂肪酸（主要α-亞麻酸[8]），揮發(fā)物[6]，紫蘇籽和果渣中迷迭香酸、芹黃素和木犀草素等[9]。酚類化合物具有抗氧化作用，預(yù)防心血管疾病，抑菌、抗癌和解毒護(hù)肝[10～13]。因此，建立一種靈敏的紫蘇籽油中酚類成分同時(shí)測(cè)定方法對(duì)紫蘇籽油功能解析與評(píng)價(jià)具有重要意義。

目前，關(guān)于多酚類化合物的檢測(cè)已有很多報(bào)道，陳磊等[14]采用高效液相色譜法檢測(cè)黃酒中多酚類成分；呂海濤等[15]以乙酸乙酯為提取劑，建立了蘋果中酚類成分定量分析方法；張?zhí)鸬萚16]采用固相萃取-高效液相色譜測(cè)定煙草樣品中多酚；胡秋芬等[17]采用微柱液相色譜法測(cè)定金銀花中的多酚類化合物。由于植物油中多酚類物質(zhì)含量底，樣品基質(zhì)復(fù)雜，酚類化合物分析需對(duì)樣品進(jìn)行富集和純化[18]，因此建立有效的前處理技術(shù)尤為重要。目前多采用液液萃取、固相萃取等技術(shù)，存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、有機(jī)溶劑量大等缺點(diǎn)[19]，多壁碳納米管因其獨(dú)特的物理結(jié)構(gòu)，巨大的比表面積而備受關(guān)注[20～22]。作為固相萃取吸附劑，多壁碳納米管具有優(yōu)異的富集性能，并且通過(guò)對(duì)其表面進(jìn)行羧基化修飾和磁性化，使得材料更加穩(wěn)定，不易聚集，能夠均勻分散在基質(zhì)樣品中，實(shí)現(xiàn)酚類物質(zhì)的高選擇性純化富集，操作過(guò)程快速簡(jiǎn)單，僅需外加磁場(chǎng)即可分離[23]。

本研究以磁性羧基化多壁碳納米管材料為基礎(chǔ)，建立了植物油中天然酚類組分富集-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，優(yōu)化了如流動(dòng)相、流動(dòng)相中酸的添加量、流速、進(jìn)樣量及碰撞能量等條件，并應(yīng)用于紫蘇籽油中多酚成分的測(cè)定，為全面認(rèn)識(shí)紫蘇籽油中酚類組分，開展紫蘇籽油的品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)功能評(píng)價(jià)提供了必要基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

液相色譜質(zhì)譜TSQ三重四級(jí)桿（美國(guó)Thermo公司）；HQ-60旋渦混合器（北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司）；BF-2000型氮?dú)獯蹈蓛x（北京八方世紀(jì)科技有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；KQ-600B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

紫蘇籽油：從主產(chǎn)區(qū)收集代表性紫蘇籽，采用實(shí)驗(yàn)室物理壓榨方式獲得紫蘇籽油。

對(duì)羥基乙醇、肉桂酸、3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)香豆酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香酸、芹黃素、木犀草素、槲皮素、甲酸（Sigma公司）；甲醇（色譜純，Merck公司）；醋酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、FeCl3·6H2O（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；石油醚、乙二醇、無(wú)水乙醇（分析純，西隴化工股份有限公司）；乙酸鈉（分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（HPLC純，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司）；羧基化多壁碳納米管（南京先豐納米材料科技有限公司，長(zhǎng)度約30 μm， 直徑<8 nm， COOH含量： 3.86%）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水，其它試劑為分析純。

2.2 HPLC-MS/MS分析條件

2.2.1 液相色譜條件 Hypersil Gold C18液相色譜柱（100 mm×2.1 mm i.d.， 3 μm），柱溫：30℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相： A為0.01%（V/V） 醋酸-甲醇溶液，B為0.01%（V/V）醋酸-水溶液；流動(dòng)相洗脫程序見(jiàn)表1。

2.2.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；負(fù)離子模式掃描；毛細(xì)管電壓：3 kV；毛細(xì)管溫度：270℃；氣簾氣（N2）：30 units；輔助氣（N2）： 5 units；碰撞氣（Ar）： 1.5 mTorr；掃描時(shí)間：0.1 s；酚類化合物的質(zhì)譜參數(shù)條件見(jiàn)表2。

2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)羥基乙醇、肉桂酸、3，4-二羥基苯甲酸、對(duì)香豆酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香酸、芹黃素、木犀草素、槲皮素各10.0 mg，分別用甲醇溶解，定容至10.0 mL，即得1.0 mg/mL單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，4℃避光保存。分別移取0.1 mL單一標(biāo)準(zhǔn)品混合，制備10.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，使用時(shí)用甲醇稀釋成不同濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.4 實(shí)驗(yàn)步驟

準(zhǔn)確稱取0.50 g紫蘇籽油樣于10 mL試管中，加入4.0 mL正己烷，增加樣品流動(dòng)性，使目標(biāo)物更快地由樣品轉(zhuǎn)移到萃取劑中。充分混勻后，加入5.0 mg磁性納米材料，渦旋提取2 min后，在試管外壁加磁鐵，靜置10 s，待液體呈透明狀，將液體倒出。 加入1.0 mL石油醚淋洗雜質(zhì)，渦旋15 s，再次在試管外壁加磁鐵，靜置10s，待液體透明，將液體倒出。選擇乙醇為洗脫溶劑，加入3.0 mL 0.02%（V/V）甲酸-乙醇，超聲6 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，氮吹濃縮，200 μL初始流動(dòng)相比例定容，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

在高效液相色譜條件中流動(dòng)相的選擇至關(guān)重要?？疾炝思状?水、乙腈-水作為流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果表明，11種酚類化合物在甲醇-水體系獲得較好分離，通過(guò)調(diào)整梯度洗脫程序，峰形和分離度基本達(dá)到要求。因此，本研究選擇甲醇-水體系為流動(dòng)相。針對(duì)部分目標(biāo)物存在峰拖尾現(xiàn)象，加入少量酸調(diào)節(jié)溶液pH值，可使單個(gè)酚類的電離受到抑制，以中性分子的形態(tài)存在，極性減弱，增強(qiáng)在固定相上的保留[11]。

3.2 酸添加量?jī)?yōu)化

反相色譜柱填料表面由于存在殘余的羥基，具有一定的酸性，而部分酚類化合物具有弱酸性，能夠與殘余硅羥基發(fā)生強(qiáng)的靜電作用力，產(chǎn)生次級(jí)保留效應(yīng)，洗脫被推遲，產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。由于酸性環(huán)境能夠抑制硅羥基的電離，流動(dòng)相中添加少量酸，可改善峰形，為了獲得準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果，考察了酸添加量的影響。

采用醋酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的酸性。對(duì)比了在水相中加入0.5%， 0.2%， 0.1%， 0.05%和0.01%（V/V）醋酸的出峰情況發(fā)現(xiàn)，在水相中加入0.01%（V/V）醋酸，效果最好，響應(yīng)值最高； 利用同樣的濃度梯度優(yōu)化了甲醇相中醋酸添加量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同樣在0.01%（V/V）的效果最好?？赡艿脑蚴牵河袡C(jī)相和水相中加入相同濃度的醋酸，保證了在梯度洗脫過(guò)程中，兩種流動(dòng)相混合時(shí)，保持恒定的醋酸濃度，pH值不發(fā)生變化，同時(shí)，這樣可使基線更加平穩(wěn)，容易平衡梯度，降低目標(biāo)物在分離過(guò)程中受干擾因素。因此，流動(dòng)相為0.01% （V/V）醋酸-甲醇和0.01%（V/V）醋酸。

3.3 流速和進(jìn)樣量選擇

流速和進(jìn)樣量對(duì)提高目標(biāo)化合物的分離效果非常重要。當(dāng)流速為200 μL/min的效果優(yōu)于250 μL/min； 考察了進(jìn)樣量分別為5， 10和20 μL的分離效果。當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL，目標(biāo)物出峰情況良好，未出現(xiàn)前沿峰和拖尾峰。因此，本研究的流速選定200 μL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

3.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

選取負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)，以＼[M-H＼]為母離子，選取離子豐度最強(qiáng)的碎片為子離子，通過(guò)優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)，信號(hào)強(qiáng)度明顯改善。質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。采用C18色譜柱，以0.01%醋酸-甲醇和0.01% 醋酸溶液進(jìn)行梯度洗脫（梯度洗脫程序見(jiàn)表1），11種酚類化合物在30 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)良好分離，保留時(shí)間見(jiàn)表2，目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的SRM色譜圖見(jiàn)圖1。

3.5 方法評(píng)價(jià)

配制10，50，100，200，500和1000 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的HPLC-MS/MS條件下進(jìn)樣檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，以目標(biāo)物平均峰面積（Y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x， ng/mL）進(jìn)行線性回歸。根據(jù)信噪比（S/N）3倍和10倍分別確定目標(biāo)物的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果見(jiàn)表3。11種酚類化合物都有較寬的線性范圍，在各相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（R2≥0.993）；LOD為0.02～0.70 ng/mL，LOQ為0.07～2.00 ng/mL；準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果見(jiàn)表4，2個(gè)加標(biāo)水平的回收率為79.61%～121.52%，RSD<15%，可以滿足實(shí)際樣品的測(cè)定需要。

將本方法與前期報(bào)道中食用油中酚類化合物定量分析方法相比，從表5可見(jiàn)，本方法分析時(shí)間短，線性范圍寬，檢出限低，能滿足實(shí)際樣品測(cè)定的需要。

3.6 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)紫蘇籽油實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，11種酚類化合物含量分別為：對(duì)羥基乙醇8.00 ng/g、肉桂酸19.0 ng/g、3，4-二羥基苯甲酸7.32 ng/g、對(duì)香豆酸46.5 ng/g、香草酸68.6 ng/g、咖啡酸32.8 ng/g、阿魏酸55.7 ng/g、丁香酸22.4 ng/g、芹黃素43.3 ng/g、木犀草素7.96 ng/g和槲皮素13.4 ng/g；其中，香草酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸、芹黃素、咖啡酸等含量較高，是紫蘇籽油主要的潛在營(yíng)養(yǎng)成分。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、流動(dòng)相中酸的添加量、流速、進(jìn)樣量及質(zhì)譜條件的優(yōu)化和考察，建立了基于磁固相萃取技術(shù)LC-MS/MS檢測(cè)紫蘇籽油種11種酚類化合物的分析方法。本方法前處理操作簡(jiǎn)單，環(huán)境友好，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度、高分析速度、低成本的目標(biāo)，結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確，為全面認(rèn)識(shí)紫蘇籽油中酚類組成，開展紫蘇籽油的品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)功能評(píng)價(jià)提供了必要基礎(chǔ)。

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