趙曉亞+王躍飛+楊帆+江振作+王琰+楊龍+潘贊紅

摘要 建立了氣相色譜法（GC）同時(shí)檢測(cè)人唾液中7種短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids， SCFAs）含量的方法。唾液樣品與乙醇溶液按體積比1∶1混合（含0.5%（V/V）濃HCl） 渦旋混合，離心后取上清液進(jìn)行GC分析。采用DB-FFAP毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）進(jìn)行分離； 氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，唾液中共檢測(cè)到7種SCFAs（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸），7種SCFAs與內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸的色譜峰峰面積比值與其濃度均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2≥0.999），檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分別為0.060～0.198 μg/mL和0.180～0.594 μg/mL，平均加樣回收率為94.8%～109.7%（RSD≤4.3%）。本方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可用于測(cè)定人的唾液中短鏈脂肪酸的含量。

關(guān)鍵詞 氣相色譜； 唾液； 短鏈脂肪酸； 腸道菌群

2015-12-05收稿； 2016-03-27接受

本文系重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目（No.2015ZX09J15102-004-004）資助

E-mail： wangyuefei_2006@hotmail.com； jeny_pan@163.com

1 引 言

短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFAs）是由益生菌，主要是腸道厭氧益生菌發(fā)酵膳食纖維和部分氨基酸和蛋白質(zhì)的終產(chǎn)物[1，2]，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和己酸等。短鏈脂肪酸不僅能為機(jī)體細(xì)胞提供能量[3]，同時(shí)具有抑制致病菌[4，5]、抑制腸道上皮細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[6]等作用，并可以調(diào)節(jié)機(jī)體代謝平衡，降低炎癥性腸病、肥胖和II型糖尿病等疾病的發(fā)生率[7]。

腸腔內(nèi)產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，一部分在腸道中被利用，另一部分進(jìn)入血液循環(huán)，通過(guò)細(xì)胞膜和粘膜的滲透作用進(jìn)入唾液[8]，或經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)輸至肺部，并隨呼吸作用到達(dá)口腔， 進(jìn)入唾液[9]。唾液成分包括少量電解質(zhì)、蛋白質(zhì)、激素、DNA、RNA以及其它小分子物質(zhì)。與血液和尿液等體液相比，唾液分析具有取樣簡(jiǎn)單、適應(yīng)性好、臨床檢驗(yàn)快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)[10]，且基于唾液和血液物質(zhì)的相關(guān)性[9，11]，臨床上可用于多種疾病的診斷[12]。唾液中含有與疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物[13]，包括蛋白質(zhì)和多肽及組織壞死、炎癥、細(xì)胞粘附、結(jié)締組織破壞和骨重塑的標(biāo)記物[14]。同時(shí)研究者也開始關(guān)注唾液樣品中的揮發(fā)性成分并試圖尋找與疾病相關(guān)的化學(xué)成分。Mueller等[15]采用GC-TOF-MS法對(duì)吸煙和非吸煙人群的唾液進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)13種代謝產(chǎn)物含量有顯著差異。Sánchez等[16]采用GC-MS方法對(duì)健康人和不同類型癌癥患者的唾液進(jìn)行分析，揭示了二甲基二硫醚和2-乙基己醇等可能是疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物。但是對(duì)唾液中揮發(fā)性有機(jī)酸的研究鮮有報(bào)道。Chen等[17]應(yīng)用離子色譜法測(cè)定了唾液中甲酸、乙酸、丙酸和乳酸的含量，但樣品處理方法過(guò)程較繁瑣。本課題組在前期工作中，應(yīng)用頂空氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定唾液和血液中8種短鏈脂肪酸，包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、異己酸、己酸，初步推測(cè)唾液-血液中短鏈脂肪酸具有一定相關(guān)性[9]。

本研究建立了氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器法測(cè)定人唾液中7種短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和己酸）的定量分析方法，并成功用于41例健康志愿者唾液樣品的分析。本方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，為尋找唾液中與疾病相關(guān)的揮發(fā)性生物標(biāo)記物奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Shimadzu GC-2010氣相色譜儀（日本Shimadzu公司）； DB-FFAP毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm， 美國(guó)Agilent公司）； Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）； SCIENTZ 25-12超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）； TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）； XS205電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、2-乙基丁酸對(duì)照品（純度≥99%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）； 其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純； 實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各短鏈脂肪酸對(duì)照品，用50%（V/V）乙醇溶解并定容，得到7種標(biāo)準(zhǔn)品的單儲(chǔ)備液，濃度分別為乙酸20.39 mg/mL、丙酸4.87 mg/mL、異丁酸0.532 mg/mL、丁酸0.657 mg/mL、異戊酸0.526 mg/mL、戊酸0.565 mg/mL、己酸0.562 mg/mL。此外， 以無(wú)水乙醇配制87.6 μg/mL 2-乙基丁酸（內(nèi)標(biāo)，IS）儲(chǔ)備液。

分別取各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，加50 μL濃HCl，以50%乙醇（V/V）定容至10 mL，得到混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度分別為： 乙酸2039 μg/mL、丙酸487.0 μg/mL、異丁酸26.60 μg/mL、丁酸65.70 μg/mL、異戊酸26.30 μg/mL、戊酸56.50 μg/mL、己酸56.20 μg/mL（含0.5%（V/V）濃HCl及4.38 μg/mL 2-乙基丁酸），并采用50%乙醇溶液（含0.5%（V/V）濃HCl及4.38 μg/mL 2-乙基丁酸）逐級(jí)稀釋，得到系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 唾液樣品的采集及供試品溶液的制備

經(jīng)志愿者（24～40周歲）同意并簽署了知情同意書，于早餐1～2 h后（樣品采集前30 min以清水漱口）采集健康志愿者的唾液樣品，以14000 r/min離心10 min，取上清液， 80℃保存?zhèn)溆谩?

取 80℃凍存的唾液樣品，靜置溶化后，取500 μL置于1.5 mL離心管中，加500 μL乙醇溶液（含1%（V/V）濃HCl及8.76 μg/mL 2-乙基丁酸），渦旋混勻，14000 r/min離心10 min，取上清液直接進(jìn)行氣相色譜分析。

2.4 氣相色譜條件[18]

色譜柱： DB-FFAP彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）； 色譜柱升溫程序： 初始溫度50℃保持1 min，以15℃/min升至120℃， 以5℃/min升至170℃， 以15℃/min升至240℃后保持3 min； 進(jìn)樣口溫度： 250℃； 氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）溫度： 250℃； 進(jìn)樣體積： 5 μL，分流比50∶1； 載氣： 高純氮?dú)猓兌?gt;99.999%）， 流速： 1.0 mL/min； 尾吹氣： 高純氮?dú)猓兌?gt;99.999%），流速： 30 mL/min； 氫氣流速： 47 mL/min； 空氣流速： 400 mL/min。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

短鏈脂肪酸為酸性化合物，在溶液中存在離子型和游離型兩種狀態(tài)[18]，加入適量HCl酸化，使短鏈脂肪酸處于游離態(tài)，有利于測(cè)定，合適的酸性條件可改善色譜分離度及峰形，因此在樣品處理過(guò)程中加入濃HCl酸化唾液樣品。考察了唾液供試品溶液中濃HCl濃度（0.1%， 0.5%， 1.0%，V/V）、唾液樣品與稀釋液比例（1∶0.5， 1∶1， 1∶2， V/V）的影響。當(dāng)唾液供試品溶液中濃HCl濃度為1.0%時(shí)，丁酸色譜峰拖尾嚴(yán)重，無(wú)法準(zhǔn)確定量； 當(dāng)濃HCl濃度為0.5%時(shí)，各短鏈脂肪酸的色譜峰形、分離度最優(yōu)。唾液樣品與稀釋液體積比為1∶0.5時(shí)，乙酸色譜峰拖尾嚴(yán)重； 唾液樣品與稀釋液體積比為1∶1時(shí)，各短鏈脂肪酸的色譜峰形、分離度最優(yōu)。綜合考慮，確定唾液樣品處理方法為唾液樣品與稀釋液（1% （V/V） 濃HCl-乙醇溶液）以體積比1∶1混合并渦旋混勻， 14000 r/min離心10 min，取上清液直接進(jìn)行GC分析。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

將空白溶液（0.5%濃HCl-50%乙醇溶液）、唾液供試品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照2.4節(jié)氣相色譜條件分析，色譜圖如圖1所示。可見，空白溶液和唾液中其它物質(zhì)色譜峰均不干擾短鏈脂肪酸分析。

將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級(jí)稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，7種短鏈脂肪酸在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.999，檢出限（S/N≥3）和定量限（S/N≥10）分別為0.060～0.198 μg/mL，0.180～0.594 μg/mL； 在方法學(xué)研究中，唾液中未檢測(cè)到戊酸和己酸，故以0.589 μg/mL戊酸和0.615 μg/mL己酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（內(nèi)標(biāo)濃度為4.38 μg/mL）進(jìn)行日內(nèi)、日間精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。7種短鏈脂肪酸的日內(nèi)精密度（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD）和日間精密度RSD分別為0.7%～3.5%和1.9%～4.4%。唾液供試品溶液室溫條件下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD為2.3%～3.6%。

準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)品溶液至健康志愿者的唾液樣品中，按照2.3節(jié)方法制備供試品溶液，進(jìn)行分析，7種短鏈脂肪酸的加樣回收率為94.8%～109.7%， RSD為1.7%～4.3%，結(jié)果見表2。

3.3 健康志愿者的唾液樣品中短鏈脂肪酸分析

在方法學(xué)驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，采用本方法測(cè)定了41例健康志愿者唾液樣品中7種短鏈脂肪酸的含量，結(jié)果為： 乙酸13.1～378 μg/mL； 丙酸1.62～101.6 μg/mL； 異丁酸0.647～6.03 μg/mL； 丁酸0.644～18.2 μg/mL； 異戊酸0.859～9.86 μg/mL； 部分唾液樣品中檢測(cè)到戊酸和己酸，且大部分樣品中戊酸和己酸含量在定量限以下。

僅一例樣品中檢測(cè)到戊酸， 含量為0.359 μg/mL； 7種短鏈脂肪酸總量為15.4～507 μg/mL。由于7種短鏈脂肪酸的含量差異懸殊，因此繪制了41例健康志愿者唾液樣品中7種短鏈脂肪酸的含量分布箱圖（圖2A），更直觀地顯示出唾液樣品中7種短鏈脂肪酸含量均在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，其原因可能是個(gè)體在飲食、腸道功能、腸道菌群種類及活力等方面的差異，導(dǎo)致產(chǎn)生的短鏈脂肪酸含量差異，最終影響了唾液中短鏈脂肪酸含量。

以乙酸為例，41例健康志愿者唾液樣品中乙酸含量分布如圖2B所示，含量在20～150 μg/mL的樣品例數(shù)占78.0%，含量低于20 μg/mL的占4.9%，含量高于150 μg/mL的占17.1%。人體唾液蘊(yùn)含大量生理信息，唾液中的成分來(lái)源途徑廣，如腮腺、牙齦齦溝液、舌下[8]和體液交換過(guò)程中的主動(dòng)運(yùn)輸或被動(dòng)擴(kuò)散[19]，所以作為一個(gè)開放的環(huán)境，檢測(cè)唾液中的成分能反映身體的健康和疾病狀況[20]。唾液中的短鏈脂肪酸有利于保持口腔的偏酸性環(huán)境，有利于抑制有害菌的滋生[4]，從而保持健康的口腔環(huán)境。測(cè)定唾液中的短鏈脂肪酸也有可能成為未來(lái)監(jiān)測(cè)人體健康狀況的一種簡(jiǎn)捷的輔助性手段。

如酸的比例分布圖表明： 唾液樣品中乙酸占短鏈脂肪酸的75.5%，丙酸占17.4%，丁酸占3.1%，三者占短鏈脂肪酸的96.0%，與文獻(xiàn)報(bào)道的人的糞便、血液中的結(jié)果[21]基本一致； 異丁酸、異戊酸和戊酸占短鏈脂肪酸的4.0%。原因可能是，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，腸腔內(nèi)產(chǎn)生的乙酸，大部分經(jīng)血液運(yùn)輸至外周，被外周組織利用； 另一部分乙酸和丙酸被運(yùn)輸至肝臟，乙酸參與合成長(zhǎng)鏈脂肪酸、谷氨酸等，丙酸進(jìn)行糖異生作用[22]。丁酸則主要作為能量物質(zhì)被腸道上皮細(xì)胞利用[23]，而異丁酸、異戊酸和戊酸由腸道菌群發(fā)酵某些特定的多肽和氨基酸產(chǎn)生[2]。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 本方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可用于人的唾液中短鏈脂肪酸的分析。

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Abstract A gas chromatographic （GC） method was established for the simultaneous analysis of seven short-chain fatty acids （SCFAs） including acetic acid， propionic acid， isobutyric acid， butyric acid， isovaleric acid， valeric acid and hexanoic acid in human saliva. Salivary sample was diluted by ethanol solution by ratio of 1∶1 （V/V）， with 0.5% （V/V） hydrochloric acid in sample solution， then vortexed and centrifuged. The supernatent was subjected to GC analysis. The chromatographic separation was performed on a DB-FFAP capillary column （30 m × 0.25 mm × 0.25 μm） using flame ionization detector （FID）. The quantification was achieved by internal standard method. The experimental results showed that an excellent correlation coefficient （R2≥0.999） was obtained for all the calibration curves of seven SCFAs. The limits of detection （LOD， S/N=3） and limits of quantitation （LOQ， S/N=10） were 0.060-0.198 μg/mL and 0.180-0.594 μg/mL， respectively. The average recoveries were 94.8%-109.7% with relative standard deviation （RSD）≤4.3% （n=6）. The developed method is simple， rapid and accurate， and suitable for the simultaneous determination of seven SCFAs in human saliva.

Keywords Gas chromatography； Saliva； Short-chain fatty acids； Gut microbiota