劉喜東等

摘 要 利用帶有酶切位點(diǎn)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段作內(nèi)標(biāo)，采取3種方式處理樣品，考察了不同的樣品處理過(guò)程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。首先合成不同長(zhǎng)度的帶有酶切位點(diǎn)的肽段，考察其酶解過(guò)程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胰蛋白酶的活性位點(diǎn)具有一定的選擇性，最終確定目標(biāo)肽段兩端分別加入3個(gè)氨基酸所形成的肽段為內(nèi)標(biāo)。分別采用在酶解前加入帶酶切位點(diǎn)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段、不帶酶切位點(diǎn)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段以及在酶解過(guò)程后、質(zhì)譜檢測(cè)前加入不帶酶切位點(diǎn)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段3種方式處理樣品。結(jié)果表明，采取第一種方式處理樣品的測(cè)定結(jié)果更接近真實(shí)值，相對(duì)偏差范圍更小，可減小蛋白質(zhì)絕對(duì)定量分析的誤差，提高分析結(jié)果的重現(xiàn)性。

關(guān)鍵詞 穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段； 絕對(duì)定量； 酶切位點(diǎn)； 藥物代謝酶

1 引 言

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，以及研究技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究正逐漸成為該領(lǐng)域方法學(xué)研究的熱點(diǎn)，使得蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容更加直觀和具體[1～3]。鑒于蛋白質(zhì)分子量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類較多、同源性較高、不易純化等特點(diǎn)，研究人員多采用生物質(zhì)譜技術(shù)和穩(wěn)定同位素標(biāo)記聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的相對(duì)定量和絕對(duì)定量研究。目前，主要的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法有穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記法（Stable isotope labeling with amino acid in cell culture， SILAC）[4，5]、穩(wěn)定同位素標(biāo)簽標(biāo)記法（如Isotope coded affinity tags， ICAT； Isobaric tags for relative and absolute quantification， iTRAQ）[6]、以及穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸、肽段、蛋白質(zhì)和肽段串聯(lián)體（Concatamers of Q peptides， QconCAT）[7，8]作為內(nèi)標(biāo)的蛋白質(zhì)定量方法。

藥物代謝酶是催化藥物在體內(nèi)代謝的一類蛋白酶，影響藥物在體內(nèi)的有效性和安全性，在藥物開發(fā)過(guò)程中受到廣泛關(guān)注[9，10]。近年來(lái)，已有文獻(xiàn)基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)藥物代謝酶進(jìn)行定量研究[11～15]，但是考慮到樣品的處理過(guò)程對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，不同方法都有各自的缺陷。為了盡量降低樣品的處理過(guò)程對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)，使內(nèi)標(biāo)肽段和肝微粒體樣本經(jīng)過(guò)共同的樣品處理過(guò)程，使得測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對(duì)經(jīng)過(guò)不同樣品處理過(guò)程所得測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，探討樣品處理過(guò)程對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，提出適用于藥物代謝酶及其它蛋白質(zhì)定量的合理方案。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Qtrap 5500型串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司），配有電噴霧離子化源以及Analyst 1.5.2 數(shù)據(jù)處理軟件； Eksigent nanoLC as-2液相系統(tǒng)（美國(guó)Eksigent），實(shí)驗(yàn)室自制毛細(xì)管Trap柱（2 cm×100 μm），Magic TM C18反相色譜柱（10 cm×75 μm，3 μm）； MALDI-TOF/TOF 5800質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）。

肽段HEIQRFADLAPIGLPHRVTKDT， IQRFADLAPIGLPHRVTK和RFADLAPIGLPHRV，穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段SVFDQDPFLLR*， VHEEIEQVIGR*， FADIVPTNIPHMTSR*， LGRSVFDQDPFLLR*VVK， EAKVHEEIEQVIGR*NRQ和VQRFADIVPTNIPHMTSR*DIK（上海楚肽生物科技有限公司）； 甲酸（色譜純，德國(guó)Fluka公司）； 尿素、碳酸氫銨、胰蛋白酶、α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA），色譜純乙腈（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）； 二硫蘇糖醇（美國(guó)Promega公司）； 碘乙酰胺（美國(guó)New Jersey公司）。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水（美國(guó)Millpore公司）。大鼠肝微粒體樣品為實(shí)驗(yàn)室自制[15]。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件

流動(dòng)相A相： 乙腈-水-甲酸（2∶98∶0.1， V/V），B相： 乙腈-水-甲酸（98∶2∶0.1， V/V）； 流速為380 nL/min。梯度洗脫程序： 0～30 min，95%～70% A； 30～33 min， 70%～20% A； 33～38 min，20% A； 38～40 min，20%～95% A； 40～45 min，95% A。進(jìn)樣體積： 5 μL。

電噴霧離子源溫度（TEM）： 150℃； 霧化氣壓力（GS1）： 30 psi（0.2 MPa）； 氣簾氣壓力（CUR）： 15 psi（0.1 MPa）； 正離子反應(yīng)模式； 離子模式噴霧電壓（IS）： 2200 V； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式離子對(duì)、碰撞電壓（CE）、去簇電壓（DP）等參數(shù)見表1。

2.3 特征肽段溶液的配制

取各肽段標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解，得1 nmol/μL各肽段儲(chǔ)備液，于-20℃保存?zhèn)溆?。取各肽段?chǔ)備液，用水稀釋，按表2配制相應(yīng)的肽段溶液。

2.4 考察帶有酶切位點(diǎn)肽段的酶解過(guò)程

分別取90 μL緩沖溶液（50 mmol/LNH4HCO3）置于3個(gè)1.5 mL EP管中，分別加入10 μL肽段溶液1、肽段溶液2和肽段溶液3，再加入2 μL胰蛋白酶溶液（0.5 μg/μL），渦流混勻，在37℃恒溫振蕩。分別于0， 5， 30和120 min取樣10 μL，加入2 μL甲酸酸化，終止反應(yīng)。以CHCA為基質(zhì)，進(jìn)行質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）測(cè)定。

2.5 3種加入內(nèi)標(biāo)肽段形式的方法考察

取3個(gè)1.5 mL EP管，編號(hào)為A1， A2和A3，每管中加入15 μL大鼠肝微粒體樣品（5 mg/mL）、75 μL緩沖溶液Ⅰ（50 mmol/L NH4HCO3、8 mol/L Urea）、8 μL二硫蘇糖醇溶液（300 mmol/L）； 分別向A1， A2和A3管中分別加入10 μL肽段溶液4、肽段溶液5和水，并渦流混勻，于37℃恒溫振蕩1 h； 向A1， A2和A3管中分別加入24 μL新鮮配制的碘乙酰胺溶液（300 mmol/L），渦流混勻，于25℃恒溫避光振蕩40 min； 向A1， A2和A3管中分別加入400 μL緩沖溶液Ⅱ（50 mmol/L NH4HCO3），渦流混勻，再加入胰蛋白酶溶液（0.5 μg/μL），于37℃恒溫振蕩； 于37℃酶解10 min后，加入甲酸溶液酸化，終止反應(yīng)； 酶解液通過(guò)固相萃取去除雜質(zhì)，用1 mL 乙腈-水-TFA（80∶ 20∶ 0.1，V/V）溶液洗脫，后于25℃離心熱干。向A1、A2管中加入50 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶，向A3管中加入40 μL 0.1%甲酸溶液和10 μL肽段溶液5復(fù)溶。取5 μL進(jìn)樣測(cè)定。

重復(fù)上述步驟，制備酶解0.5， 2， 6和16 h的肝微粒體樣品，并進(jìn)行測(cè)定，考察酶解時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

3 結(jié)果與討論

3.1 帶有酶切位點(diǎn)肽段的酶解過(guò)程考察

在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，可采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的定量分析。在具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，不同研究者加入內(nèi)標(biāo)肽段的步驟并不相同，包括在蛋白樣品酶解后、質(zhì)譜檢測(cè)前加入內(nèi)標(biāo)肽段； 或者在蛋白樣品酶解前加入內(nèi)標(biāo)肽段，使內(nèi)標(biāo)肽段與樣品共同進(jìn)行酶解過(guò)程和樣品除鹽純化過(guò)程。考慮到肽段在樣品酶解過(guò)程中部分降解，以及樣品處理過(guò)程中肽段的損失，因此越早將內(nèi)標(biāo)肽段和蛋白樣品混合，理論測(cè)定結(jié)果越可靠。由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，蛋白質(zhì)的酶解速率和酶解程度對(duì)測(cè)定結(jié)果也會(huì)有影響，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽段串聯(lián)體等方法即是希望通過(guò)同步酶解過(guò)程以降低酶解過(guò)程帶來(lái)的誤差，但穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)或串聯(lián)體的制備過(guò)程相對(duì)復(fù)雜且成本較高。因此，本研究設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)，加入到肝微粒體樣品中，進(jìn)行同步酶解和樣品處理過(guò)程，以最大限度地提高蛋白樣品測(cè)定的準(zhǔn)確性。

實(shí)驗(yàn)中，首先以肽段FADLAPIGLPHR為研究對(duì)象，合成具有不同氨基酸數(shù)目的帶有酶切位點(diǎn)的肽段，考察RFADLAPIGLPHRV、IQRFADLAPIGLPHRVTK和HEIQRFADLAPIGLPHRVTKDT的酶解過(guò)程，以選擇合適的帶有酶切位點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)肽段。由圖1可見，當(dāng)目標(biāo)肽段（FADLAPIGLPHR）兩端分別添加1個(gè)氨基酸時(shí)，RFADLAPIGLPHRV不能被酶解產(chǎn)生FADLAPIGLPHR； 當(dāng)目標(biāo)肽段兩端分別加上3個(gè)和5個(gè)氨基酸時(shí)，IQRFADLAPIGLPHRVTK和HEIQRFADLAPIGLPHRVTKDT都能被酶解產(chǎn)生FADLAPIGLPHR，說(shuō)明胰蛋白酶的活性位點(diǎn)具有一定的選擇性，能選擇性的對(duì)肽段進(jìn)行酶切。為了達(dá)到內(nèi)標(biāo)肽段能被酶切的目的，并考慮到節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，本實(shí)驗(yàn)采用在目標(biāo)肽段兩端分別加上3個(gè)氨基酸的研究方案。

實(shí)驗(yàn)中考察了肽段IQRFADLAPIGLPHRVTK的酶解過(guò)程。如圖2所示，肽段IQRFADLAPIGLPHRVTK的兩個(gè)酶切位點(diǎn)不是同時(shí)進(jìn)行酶切的，這可能與酶切位點(diǎn)處氨基酸的性質(zhì)有關(guān)。通過(guò)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，可實(shí)現(xiàn)對(duì)帶有酶切位點(diǎn)肽段的完全酶切。

3.2 藥物代謝酶定量方法的建立

實(shí)驗(yàn)以UGT1A1、CYP2A1和CYP2D26為研究對(duì)象，其水解后可產(chǎn)生的特征肽段分別為SVFDQDPFLLR、VHEEIEQVIGR和FADIVPTNIPHMTSR，通過(guò)計(jì)算樣品中的特征肽段與其已知濃度同位素標(biāo)記肽段的峰面積比值，得到特征肽段含量，計(jì)算得出酶含量。為了提高方法的可靠性，降低儀器因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)針對(duì)每個(gè)肽段選用兩個(gè)離子對(duì)進(jìn)行定量分析，取兩個(gè)結(jié)果的平均值進(jìn)行計(jì)算。

以3種形式加入同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽段，分別為： 在肝微粒體樣品酶解前加入帶有酶切位點(diǎn)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段，使內(nèi)標(biāo)肽段和樣品進(jìn)行同步酶解和樣品處理過(guò)程； 在肝微粒體樣品酶解前加入不帶有酶切位點(diǎn)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段，使內(nèi)標(biāo)肽段和樣品進(jìn)行同步酶解和樣品處理過(guò)程； 在肝微粒體樣品經(jīng)過(guò)酶解和樣品處理后、質(zhì)譜檢測(cè)前，加入不帶有酶切位點(diǎn)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段。本研究組曾采用第III種方法對(duì)大鼠肝微粒體中細(xì)胞色素P450和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶亞型進(jìn)行了絕對(duì)定量分析[15]，但沒(méi)有與前兩種方式做系統(tǒng)比較。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察了3種形式加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段做內(nèi)標(biāo)對(duì)定量結(jié)果的影響。

3.3 酶解過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

以上述3種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段，分別在10 min， 30 min， 2 h， 6 h和16 h終止反應(yīng)，考察不同酶解作用時(shí)間下3種方式加入內(nèi)標(biāo)的結(jié)果。以特征肽段SVFDQDPFLLR為例，分別計(jì)算3種形式加入內(nèi)標(biāo)時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定結(jié)果的平均值，再計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定值相對(duì)于平均值的相對(duì)偏差，以時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差為縱坐標(biāo)作圖（圖3）。圖3中各點(diǎn)可表示不同形式加入內(nèi)標(biāo)時(shí)，樣品中特征肽段實(shí)際含量的相對(duì)變化。

如圖3a所示，對(duì)于特征肽段SVFDQDPFLLR，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，以第Ⅲ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，測(cè)得特征肽段的含量先增加后略降低，在10 min時(shí)，蛋白沒(méi)有完全酶解，測(cè)定值負(fù)偏差較大，在2 h時(shí)蛋白基本完全酶解成肽段，隨后產(chǎn)生的特征肽段發(fā)生部分降解； 以第Ⅰ、Ⅱ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，測(cè)得特征肽段的含量逐漸增加，說(shuō)明添加的內(nèi)標(biāo)肽段也發(fā)生部分降解，特征肽段與內(nèi)標(biāo)肽段在樣品中變化一致，測(cè)定結(jié)果更接近真實(shí)值。以第Ⅰ和Ⅱ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)測(cè)定值基本一致，說(shuō)明帶有酶切位點(diǎn)肽段在樣品中迅速酶解。

如圖3b所示，對(duì)于特征肽段VHEEIEQVIGR，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，以第Ⅲ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，測(cè)得特征肽段的含量先增加，后稍許降低，在10 min時(shí)，蛋白沒(méi)有完全酶解，測(cè)定值負(fù)偏差較大，在2 h時(shí)，蛋白基本完全酶解； 以第Ⅱ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，測(cè)得特征肽段的含量逐漸增加，在16 h時(shí)正偏差較大，說(shuō)明蛋白酶解產(chǎn)生的特征肽段降解程度多于內(nèi)標(biāo)肽段； 以第Ⅰ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，測(cè)得特征肽段的含量整體趨勢(shì)逐漸降低，在10 min時(shí)，正偏差較大，說(shuō)明帶有酶切位點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)肽段沒(méi)有酶解完全，在2 h時(shí)，基本酶解。以第Ⅰ、Ⅱ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定值變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明帶有酶切位點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)肽段和無(wú)酶切位點(diǎn)內(nèi)標(biāo)肽段在樣品中變化過(guò)程一致。

如圖3c所示，對(duì)于特征肽段FADIVPTNIPHMTSR，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，以第Ⅲ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，測(cè)得特征肽段的含量先增加，后顯著降低，說(shuō)明在10 min時(shí)，蛋白沒(méi)有完全酶解，等蛋白完全水解成肽段后，特征肽段又明顯降解，使得測(cè)定值負(fù)偏差較大； 以第Ⅱ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，測(cè)得特征肽段的含量逐漸增加，后基本不變，說(shuō)明加入的內(nèi)標(biāo)肽段也發(fā)生降解，降解速度與特征肽段一致； 以第Ⅰ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，測(cè)得特征肽段的含量先增加，后基本不變，說(shuō)明在10 min時(shí)，帶有酶切位點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)肽段沒(méi)有酶解完全。由于蛋白酶解產(chǎn)生的特征肽段發(fā)生降解，當(dāng)加入帶有酶切位點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，特征肽段與內(nèi)標(biāo)肽段在樣品中變化過(guò)程基本一致，測(cè)定值更接近真實(shí)值。

上述3種特征肽段的定量結(jié)果反映了以同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行蛋白定量時(shí)的普遍問(wèn)題。如圖3a所示，由于蛋白水解產(chǎn)生的特征肽段發(fā)生降解，以第Ⅲ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，測(cè)定的結(jié)果與理論值相比偏低； 如圖3b所示，以第Ⅱ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值更接近，但是特征肽段從生成后開始稍許降解，而內(nèi)標(biāo)肽段從加入后開始稍許降解，測(cè)定結(jié)果比真實(shí)值稍偏大； 如圖3c所示，以第Ⅰ種方式加入內(nèi)標(biāo)肽段時(shí)，由于帶有酶切位點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)肽段需要經(jīng)過(guò)酶切過(guò)程，內(nèi)標(biāo)肽段與蛋白在樣品中的過(guò)程更接近一致，使最終的測(cè)定結(jié)果更接近真實(shí)值，相對(duì)偏差范圍更小。因此，選用帶有酶切位點(diǎn)的同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)的定量結(jié)果更接近真實(shí)值，方法的偏差也最小。

3.4 基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)的藥物代謝酶定量方法總結(jié)

利用LC-MS/MS技術(shù)，通過(guò)計(jì)算特征肽段與其同位素標(biāo)記肽段峰面積的比值來(lái)測(cè)定蛋白的含量是目前公認(rèn)的最佳的的蛋白質(zhì)定量方法，但是需要注意以下問(wèn)題： （1）需考察特征肽段在樣品處理過(guò)程中的穩(wěn)定性，盡量選擇在樣品長(zhǎng)時(shí)間處理過(guò)程中較穩(wěn)定的特征肽段； （2）對(duì)于內(nèi)標(biāo)肽段，可將其與樣品混合后再進(jìn)行樣品酶解等處理過(guò)程，這樣可以降低樣品處理過(guò)程引入的偏差； （3）內(nèi)標(biāo)肽段的純度可用氨基酸水解法進(jìn)行標(biāo)定，保證內(nèi)標(biāo)肽段的含量準(zhǔn)確； （4）可選擇帶有酶切位點(diǎn)的標(biāo)記肽段或標(biāo)記肽段的串聯(lián)體（QconCAT）作為內(nèi)標(biāo)[16]，提高方法的準(zhǔn)確性，特別適用于難以確定穩(wěn)定的特征肽段的蛋白序列，但是需要考察每個(gè)內(nèi)標(biāo)肽段的酶解過(guò)程，這樣才能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確性； （5）蛋白樣品的處理過(guò)程可根據(jù)特征肽段的特點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，包括樣品的酶解過(guò)程的時(shí)間和體系中酶濃度等。

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