唐秀鳳劉仁慧年宏蕾肖般若惠婭楊燕羅良濤許利平王秀娟

（首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069）

·研究報(bào)告·

淫羊藿、女貞子協(xié)同地塞米松影響哮喘大鼠糖皮質(zhì)激素受體的研究*

唐秀鳳劉仁慧△年宏蕾肖般若惠婭楊燕羅良濤許利平王秀娟

（首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069）

目的觀察中藥淫羊藿、女貞子對地塞米松干預(yù)大鼠哮喘模型全身及局部不同水平糖皮質(zhì)激素受體（GR）的影響。方法建立大鼠哮喘模型，腹腔注射地塞米松2周治療，同時(shí)配合灌胃淫羊藿女貞子煎液，流式細(xì)胞術(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）與血淋巴細(xì)胞中GR蛋白及GR結(jié)合力的表達(dá)。結(jié)果哮喘模型組血淋巴細(xì)胞及BALF中GR結(jié)合力均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與哮喘模型組比較，激素干預(yù)組BALF中GR蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.01），血淋巴細(xì)胞及BALF中GR結(jié)合力均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；應(yīng)用激素的同時(shí)合用淫羊藿女貞子，能顯著上調(diào)BALF中GR蛋白量（P＜0.05）及血淋巴細(xì)胞及BALF中GR結(jié)合力（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論在激素應(yīng)用的同時(shí)合用中藥淫羊藿、女貞子在整體及局部水平均能提高因糖皮質(zhì)激素（GC）干預(yù)下降的GC結(jié)合力，改善GR對GC的耐受，提高支氣管肺組織及機(jī)體對激素的敏感性。

哮喘淫羊藿女貞子地塞米松糖皮質(zhì)激素受體（GR）

隨著對哮喘發(fā)病機(jī)制的深入研究，氣道炎癥學(xué)說得以確立，因?yàn)樘瞧べ|(zhì)激素（GC）具有良好的抗炎作用，所以臨床應(yīng)用GC作為防治哮喘的首選藥，而臨床實(shí)踐中使用GC是一把雙刃劍。在治療疾病的同時(shí)會(huì)出現(xiàn)，如激素依賴、激素抵抗以及局部和全身性副作用［1］。中醫(yī)學(xué)在治療哮喘及對于激素造成的不良反應(yīng)也有很好的療效。前期研究結(jié)果提示，在哮喘模型激素治療的不同時(shí)段給予適量中藥淫羊藿、女貞子，可呈現(xiàn)“減毒增效”的藥效［2-3］。GC生物學(xué)作用的發(fā)揮主要取決于和GR的結(jié)合及之后啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄進(jìn)程［4］。為進(jìn)一步研究中藥所發(fā)揮作用的機(jī)制，筆者對比研究整體（血淋巴細(xì)胞）及局部（支氣管肺泡灌洗液，BALF）不同水平中GR蛋白及GR結(jié)合力的改變，探索中藥淫羊藿、女貞子合用GC治療哮喘的協(xié)同作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物雄性SPF級(jí)SD大鼠30只，體質(zhì)量（120± 10）g，合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水、攝食。

1.2試劑與儀器402A超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司），流式細(xì)胞儀FACS Calibur（美國BD公司），霧化箱（以有機(jī)玻璃為材料自制，規(guī)格：40 cm×30 cm× 20 cm）。卵清白蛋白（OVA，美國Sigma公司，A5253-250 g）、氫氧化鋁（北京化工廠，批號(hào)20120028）；淫羊藿水提物（批號(hào)20130115）、女貞子水提物（批號(hào)20130104）（西安康威生物有限公司）；地塞米松磷酸鈉注射液（5 mg/支，國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號(hào)H41020036）；大鼠外圍血淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號(hào)LTS1083-200）；GR單克隆一抗（Abcam，批號(hào)ab9568）；Fitc-GR二抗（Abcam，批號(hào)ab51379）；PE-地塞米松（Molecular Probes，批號(hào)D1383）。

1.3分組與造模按照隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組，正常對照組（N組）、哮喘模型組（A組）、激素干預(yù)組（GC組），淫羊藿女貞子組（YN組），淫羊藿女貞子合激素干預(yù)組（YN+GC組），每組6只。于實(shí)驗(yàn)1～35 d，除N組外，其余動(dòng)物全部造模。實(shí)驗(yàn)22 d開始給藥共計(jì)2周，GC組及YN+GC組腹腔注射地塞米松注射液（0.5 g/kg）；YN組及YN+GC組給予淫羊藿女貞子水提物（4：3配比，3.5 g/kg）；N組及A組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液［5］。

1.4觀察指標(biāo)實(shí)驗(yàn)36 d處死動(dòng)物，腹主動(dòng)脈取血抗凝，參考試劑盒說明書分離淋巴細(xì)胞；開胸，取肺組織連同氣管，行支氣管肺泡灌洗術(shù)［6］，回收支氣管肺泡灌洗液（BALF）離心，收集BALF細(xì)胞沉渣。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血淋巴細(xì)胞及BALF細(xì)胞GR蛋白表達(dá)及GR結(jié)合力［7］。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析及相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠血淋巴細(xì)胞及BALF中GR蛋白表達(dá)量的比較見表1。與N組比較，A組血淋巴細(xì)胞及BALF中GR蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與A組比較，GC組BALF GR蛋白含量明顯降低（P＜0.01），而血淋巴細(xì)胞GR蛋白含量無顯著改變（P＞0.05）；與GC組比較，YN+GC組BALF GR蛋白含量顯著升高（P＜0.05）。

表1　各組大鼠血淋巴細(xì)胞及BALF中GR蛋白表達(dá)量比較（平均熒光強(qiáng)度，±s）

表1　各組大鼠血淋巴細(xì)胞及BALF中GR蛋白表達(dá)量比較（平均熒光強(qiáng)度，±s）

與N組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與A組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與GC組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同。

組別n血淋巴細(xì)胞GR蛋白BALF GR蛋白N組67435.33±1616.992505.17±355.87 A組66887.33±1621.602069.50±482.77 GC組67808.33±2164.57**1517.00±410.02**△△YN組66728.50±2055.912383.17±423.27▲▲YN+GC組68586.17±2086.272143.83±323.72▲

2.2各組大鼠血淋巴細(xì)胞及BALF中GR結(jié)合力的比較見表2。與N組比較，A組血淋巴細(xì)胞及BALF中GR結(jié)合力均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與A組比較，GC組血淋巴細(xì)胞及BALF中GR結(jié)合力均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；與GC組比較，YN+GC組血淋巴細(xì)胞及BALF中GR結(jié)合力均顯著上升（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各組大鼠血淋巴細(xì)胞及BALF中GR結(jié)合力比較（平均熒光強(qiáng)度，±s）

表2　各組大鼠血淋巴細(xì)胞及BALF中GR結(jié)合力比較（平均熒光強(qiáng)度，±s）

組別n血淋巴細(xì)胞GR結(jié)合力BALF GR結(jié)合力N組63214.33±468.4527777.83±5505.21 A組62653.33±480.80*18888.17±4535.93**GC組62221.33±401.28**△8567.33±2204.33**△△YN組62792.33±287.29▲21862.67±3442.39▲▲YN+GC組62712.33±451.52▲16715.83±3411.94▲▲

2.3GR蛋白表達(dá)與GR結(jié)合力的相關(guān)分析見表3。血淋巴細(xì)胞GR蛋白表達(dá)量均與血淋巴細(xì)胞、BALF兩個(gè)水平中GR結(jié)合力無相關(guān)；而BALF中GR蛋白表達(dá)量均與兩個(gè)水平的GR結(jié)合力均呈顯著正相關(guān)（r= 0.468、0.540，均P＜0.01）；此外，GR結(jié)合力在血淋巴細(xì)胞與BALF兩個(gè)水平有顯著性正相關(guān)（r=0.587，P＜0.01）。

表3　GR蛋白表達(dá)與GR結(jié)合力的相關(guān)性分析（r值，n=30）

3　討論

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在地塞米松治療哮喘模型動(dòng)物的不同時(shí)段合用淫羊藿和女貞子，可以協(xié)同GC增強(qiáng)抗炎并減輕GC所引起的不良反應(yīng)［4-5］，提示對內(nèi)源性GC作用途徑受損有良好的保護(hù)作用，可能通過恢復(fù)激素的敏感性從而發(fā)揮激素的強(qiáng)大抗炎作用。GC發(fā)揮其生理和藥理作用依賴于和GR結(jié)合，通過反式抑制或反式激活作用分別抑制或激活細(xì)胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄。有研究認(rèn)為，GR缺陷在哮喘發(fā)病機(jī)制中具有重要意義，無論何種程度的支氣管哮喘，其外周血白細(xì)胞GR水平均明顯降低，且哮喘越嚴(yán)重，這種受體水平的下降越顯著［8］。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血淋巴細(xì)胞（整體水平）與BALF（局部）中GR蛋白表達(dá)及GR結(jié)合力，評價(jià)外源性激素全身用藥對哮喘大鼠整體及局部不同水平中的GR功能的影響及中藥協(xié)同激素的作用。結(jié)果顯示，哮喘模型大鼠的GR結(jié)合力在整體及局部水平均顯著降低，提示哮喘大鼠存在GR功能下降，從而導(dǎo)致激素用藥的敏感性降低。與A組比較，GC組血淋巴細(xì)胞及BALF中GR結(jié)合力進(jìn)一步下調(diào)，且出現(xiàn)BALF GR蛋白量明顯降低，提示激素的全身應(yīng)用，不僅在整體及局部出現(xiàn)GR功能的顯著抑制，且對局部GR蛋白表達(dá)亦有下調(diào)；結(jié)合相關(guān)分析結(jié)果顯示，哮喘大鼠在整體及局部兩個(gè)水平的GR結(jié)合力同步下降，而兩個(gè)水平的GR結(jié)合力又均與BALF蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了激素全身用藥治療哮喘時(shí)，對GR蛋白功能的抑制作用更明顯，對GR蛋白表達(dá)量的抑制主要出現(xiàn)在局部，可導(dǎo)致機(jī)體對激素的敏感性逐漸下降。而應(yīng)用激素的同時(shí)合用淫羊藿、女貞子，能顯著上調(diào)BALF GR蛋白表達(dá)及血淋巴細(xì)胞、BALF中GR結(jié)合力，在整體及局部水平均能提高因GC干預(yù)下降的GR與GC的結(jié)合能力，改善GR對GC的耐受，提高支氣管和肺組織對GC作用的敏感性，以更好地發(fā)揮內(nèi)源性GC對機(jī)體的保護(hù)作用，這可能是平補(bǔ)陰陽中藥淫羊藿、女貞子協(xié)同GC治療哮喘發(fā)揮協(xié)同作用并緩解GC不良反應(yīng)的可能作用機(jī)制之一。

［1］戎霞君，李以琳，蔡映云.吸入激素防治哮喘存在的問題和對策［J］.國外醫(yī)學(xué)：內(nèi)科學(xué)分冊，2002，29（2）：64-66.

［2］劉仁慧，王秀娟，袁穎，等.淫羊藿、女貞子對激素干預(yù)哮喘大鼠骨代謝的影響［J］.吉林中醫(yī)藥雜志，2012，32（5）：490-492.

［3］劉仁慧，許利平，王秀娟，等.淫羊藿女貞子合用地塞米松抗哮喘大鼠的研究［J］.中國中藥雜志，2012，37（10）：1497-1499.

［4］王力寧，羅梅芳，黃小琪，等.六味地黃丸（顆粒）對哮喘小鼠糖皮質(zhì)激素受體mRNA作用的研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（9）：393-1397.

［5］劉仁慧，鄭君芳，袁穎，等.淫羊藿女貞子配伍調(diào)節(jié)哮喘大鼠NO/ET及HPA軸作用的研究［J］.中國中藥雜志，2010，35（12）：1590-1593.

［6］劉仁慧，王秀娟，許利平，等.培本方對哮喘模型大鼠的藥效學(xué)研究［J］.中成藥，2009，2010，32（5）：741-744

［7］劉仁慧，王秀娟，張偉華，等.淫羊藿女貞子對激素干預(yù)哮喘大鼠模型HPA軸及GR的影響研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（11）：3215-3219.

［8］王力寧，羅梅芳，黃小琪，等.六味地黃丸（顆粒）對哮喘小鼠糖皮質(zhì)激素受體mRNA作用的研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（9）：1393-1396.

Effects of the Combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi on GR in the Asthmatic Rats with Dexamethasone Intervention

TANG Xiufeng，LIU Renhui，NIAN Honglei，et al.
School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University and Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Collateral Disease Theory Research，Beijing 100069，China

Objective：To investigate the effects of the combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi on GR in the asthmatic rats with dexamethasone intervention.Methods：Asthmatic model was duplicated by OVA（ovalbumin）through sensitizing and challenging in rats.With the injection of dexamethasone and（or）the oral administration of the combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi，the protein expression and binding force of GR in blood lymphocyte and BALF were observed by flow cytometry.Results：Compared with the normal group，the binding forces of GR in the blood lymphocytes and BALF in model group were significantly decreased（P＜0.01 or P＜0.05）.Compared with the model group，GR protein content of BALF and the binding force of GR of the blood lymphocytes and BALF in the GC group were significantly lower（P＜0.05 or P＜0.01）. Application of the hormone accompanied by the combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi could significantly increased GR protein content in BALF and the binding force of GR in the blood lymphocytes and BALF（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：The combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi can improve the sensitivity of the lung tissue and the body to the hormone.

Asthma；Herba Epimedii/Fructus Ligustri Lucidi；Dexamethasone；GR

R285.5

A

1004-745X（2015）10-1699-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.003

2015-06-16）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81373814）；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（No. CIT&TCD201504097）；北京中醫(yī)藥薪火傳承“3+3”工程二室一站建設(shè)項(xiàng)目（No.2012-SZ-C-42）

（電子郵箱：gzblrh@ccmu.edu.cn）