舒彥芳，馬小花，杜詩熠，任 敏

(1.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300;2.新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆阿拉爾843300)

堿性磷酸酶(Akaline phosphatases，AP，EC 3.1.3.1)是在堿性條件下將有機磷化合物釋放為無機磷的一種低特異性的磷酸單脂酶。該酶在酶聯(lián)免疫測定、生物傳感器、雜交和測序、分子遺傳學、農(nóng)業(yè)生活中起非常重要的作用。從微生物到真核生物都可以找到該酶的蹤跡，尤其是一些生活磷限制環(huán)境的微生物細胞，其堿性磷酸酶在碳、氮代謝中起非常重要的作用［1-2］。

從1960年開始，各種來源的堿性磷酸酶被陸續(xù)報道。大腸桿菌的堿性磷酸酶的結構、功能及催化特性是研究得最為清楚的。許多哺乳動物的堿性磷酸酶已被研究。研究者從深海的火山口附近分離出一種產(chǎn)堿性磷酸酶的古熱球菌。該菌的堿性磷酸酶能耐100℃高溫。自極端環(huán)境獲得的微生物所產(chǎn)生的酶及基因產(chǎn)物由于能夠在特定的苛刻條件下保持穩(wěn)定并發(fā)揮較大的酶活，已引起研究者們極大的興趣［3-5］。筆者就從實驗室保存的極端嗜鹽古菌進行堿性磷酸酶初步篩選，并對酶活高的菌株進行形態(tài)學、基因型等進行鑒定，為工業(yè)用酶的開發(fā)以及極端來源堿性磷酸酶嗜極機制的后續(xù)研究提供材料和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基。極端嗜鹽古菌tarim4為實驗室分離自硝爾庫勒鹽湖(40°41＇N，76°53＇E)。培養(yǎng)基中含酸水解酪蛋白7.5 g/L，酶母提取物10 g/L，檸檬酸三鈉3 g/L，MgSO4·7H2O 20 g/L，KCl 2 g/L，F(xiàn)eCl2·4H2O 0.036 9 g/L，NaCl 200 g/L，pH 7.2。蒸餾水900 ml，高溫滅菌。標準菌株Natrinema pellirubrum CGMCC 1.3708T購自中國科學院微生物所。

1.1.2 主要試劑和設備。試劑有1×TE溶液、溶菌酶(50 mg/ml)、DNA聚合酶(廣州東盛)、pMD18-T載體(大連TaKaRa)、DNA 回收純化試劑盒(上海生工);IPTG、X-gal、濃度20%NaCl溶液、磷酸苯二鈉、Q瓊脂糖凝膠FF/Q Sep、Superdex 20050mM Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液，瓊脂糖凝膠柱(10 mm ×300 mm)。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學特征。細胞形態(tài)、運動性按照文獻［6］進行。

1.2.2 生理生化生長條件及抗生素敏感。按照文獻［6］檢測以下指標:菌體細胞生長所需鹽濃度范圍及最適NaCl、MgCl2、pH、溫度等;硝酸鹽、精氨酸和二甲基亞砜的厭氧實驗，硝酸鹽、亞硝酸鹽還原硝酸鹽產(chǎn)氣，H2S產(chǎn)氣，碳氮利用及抗生素敏感。主要用的抗生素有紅霉素、氯霉素、利福平、桿菌肽、青霉素、新霉素、氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、新生霉素、氟哌酸、鏈霉素、萬古霉素、卡那霉素、呋喃妥因、甲氧芐啶。

1.2.3 基本碳源和能源物質(zhì)生長利用。按照文獻［7］進行基本碳源和能源生長利用試驗。所選擇的42種碳、氮源為:葡萄糖、半乳糖、棉籽糖、甘露糖、果糖、L-山梨糖、D-木糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘油、甘露醇、D-山梨醇、醋酸鹽、丙酮酸鹽、DL-乳酸鹽、琥珀酸鹽、延胡索酸鹽、L-蘋果酸鹽、檸檬酸鹽、L-結氨酸、甘氨酸 L-丙氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-脯氨酸、L-天冬酰胺、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-絲氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸鹽、L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析。

1.2.4.1 16S rRNA基因的PCR擴增。按照文獻［6］進行菌體總DNA的提取。古菌16S rRNA基因通用引物F1:5＇-TTCCGGTTGATCCTGCC-3＇ 和 R1:5＇-AAGGAGGTGATCCAGCC-3＇，擴增片段大小約1.5 kb。PCR反應體系:10×Taq緩沖液 2.5 μl，dNTP 混 合 物 (2.5 mmol/L)3 μl，F(xiàn)1(10 μmol/L)0.5 μl，R1(10 μmol/L)0.5 μl，Taq 酶(5 U/μl)0.3 μl，模板 DNA 0.5 μl，ddH2O 補至 25 μl。PCR 反應條件為:95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30 個循環(huán)，72℃10 min。將PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠1%(W/V)電泳，染色后在凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照(目的條帶大小為1.5 kb)。

1.2.4.2 克隆測序。將目的大小的PCR產(chǎn)物回收、純化后與pMD18-T載體相連，重組片段經(jīng)過DH5α大腸桿菌克隆增殖后，用上述古菌通用引物菌落PCR驗證，選取陽性克隆20個，送由上海生物工程有限公司測序。

1.2.4.3 16S rRNA基因分析。用DNAStar軟件包中Seq-Man軟件剪輯所得序列，剪輯后序列通過Eztaxon server 2.1分析其潛在的分類地位，并且采用MEGA5.0軟件包中的Clustal W對下載相關序列多位序列比較，對比較后的序列采用N-J法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 DNA的G+C mol%含量測定。G+C mol%含量測定采用熱變性溫度法(Tm值法)［7］。

1.3 酶活檢測及酶純化

1.3.1 堿性磷酸酶活性檢測［8］。將新鮮菌懸液離心，用液氮和常溫反復凍融，12 000 r/min，4℃ 離心10 min，取上清液500 μl加到1 000 μl含4-氨基安替比林(0.15%，W/V)的碳酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 10)，37℃水浴5 min，再加入磷酸苯二鈉(0.02 mol/L)1 000 μl，37℃水浴15 min后立刻加入3 μl鐵氰化鉀溶液，立即充分混勻后，將其在分光光度計510 nm波長處比色，用蒸餾水調(diào)零，以未接種的培養(yǎng)液為對照。酶活定義為37℃下每分鐘產(chǎn)生1 μmol游離酚的酶量為一個酶活單位(U)。

1.3.2 微孔板法初篩堿性磷酸酶產(chǎn)生菌。將0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液(4-氨基安替比林，pH 10.0)50 μl點樣于40孔微孔板中(對照孔加量為55 μl)，用無菌牙簽取各菌種等量菌苔與上述緩沖液充分混勻，37℃水浴5 min放置后，將已預熱的磷酸苯二鈉溶液(0.02 mol/L)50 μl加入孔中，37℃反應15 min后加入鐵氰化鉀溶液150 μl，顯色，并終止反應。以紅色作為初篩產(chǎn)堿性磷酸磷酸酶的菌體。

1.3.3 酶的純化及SDS-PAGE檢測［9］。

1.3.3.1 制備粗酶液。新鮮菌液按1%接入2 L CM(濃度20%NaCl，pH 8.0)液體培養(yǎng)基中，放入 37℃ 搖床，200 r/min培養(yǎng)72 h左右。當OD600nm在1.0以上時，10 000×g離心10 min，4℃，收集菌體。菌體用50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)重懸，超聲裂解。10 000×g離心20 min，4℃ 離心，上清即為粗酶液體。粗酶液體-80℃ 保存。

1.3.3.2 (NH4)2SO4沉淀。將上述粗酶液體加入硫酸銨至80% 飽和度，4℃ 靜置過夜。10 000×g離心15 min，將沉淀溶解Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.0)緩沖液，將酶液脫鹽冷凍干燥后-40°保存。

1.3.3.3 初步純化酶蛋白。將上述脫鹽的酶液用平衡液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)溶解，加到用50 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0充分平衡后的Q瓊脂糖凝膠FF柱，用0.1～2.0 mol/L NaCl(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗脫液洗脫，收集0.4 ～0.8 mol/L NaCl(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，各個組分放于-80℃保存。

2 結果與分析

2.1 菌株形態(tài)學特征 細胞呈球形(圖1)，大小2.73 μm，無鞭毛，能運動。革蘭氏陰性菌，在牛奶鹽平板上培養(yǎng)至7 d時菌落呈圓形，橘色，表面光滑濕潤，有黏性，邊緣較整齊，菌落直徑為1～2 mm。

2.2 生理生化及生長條件、抗生素敏感試驗

2.2.1 生理生化及生長條件。

2.2.1.1 溫度對菌株生長的影響。tarim4在溫度37～40℃時都能生長，但是37℃是最適的生長溫度。

2.2.1.2 NaCl質(zhì)量濃度對菌株生長的影響。tarim4在NaCl質(zhì)量濃度為8% ～20% 的培養(yǎng)基中生長良好，最適生長為15%;NaCl濃度12% ～23%是tarim4和Natrinema pellirubrum CGMCC 1.3708T生長較適合的范圍。

2.2.1.3 Mg2+質(zhì)量濃度對菌株生長的影響。tarim4不需要Mg2+就能進行生長。相比較來說，Mg2+濃度0.005～0.3 mol/L是菌株Natrinema pellirubrum CGMCC 1.3708T較適合生長的范圍。

2.2.1.4 pH對菌株生長的影響。tarim4生長所需pH為4.0～11.0，最適pH 8.5，而參照菌株Natrinema pellirubrum CGMCC 1.3708T生長所需的pH 6.0～8.0都可以生長。

2.2.1.5 抗生素敏感試驗。菌株tarim4對桿菌肽、新生霉素敏感，對紅霉素、新霉素、利福平、氯霉素、氨芐青霉素、諾氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、萬古霉素、制霉菌素、呋喃妥因、萘啶酸等不敏感。

2.2.2 碳、氮源利用。菌株tarim 4能利用果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、甘油、甘露醇、D-山梨醇、醋酸鹽、DL-乳酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、L-鳥氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸鹽等作為唯一碳源、能源生長，不能利用甘露糖、半乳糖、L-山梨糖、D-木糖、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-絲氨酸、L-亮氨酸等;而相近菌株Natrinema pellirubrumCGMCC1.3708T能利用葡萄糖、半乳糖、L-山梨糖、D-木糖、DL-乳酸鹽、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-鳥氨酸、L-絲氨酸等，不能利用甘露糖、果糖、D-核糖、阿拉伯糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘油、甘露醇、D-山梨醇、醋酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、L-賴氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸鹽。它們在碳源、氮源的利用上存在差異。

2.3 基因型特征

2.3.1 16S rRNA基因。

2.3.1.1 16S rRNA基因擴增。采用古菌通用引物，對tarim4所提取的基因組DNA進行16S rRNA基因序列擴增且測序，得到幾乎全長的16S rRNA基因序列，經(jīng)過電泳檢測，條帶大小約為1.5 kb(圖2)。序列提交NCBI，并獲得登錄號(JX44467)。

2.3.1.2 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析。將tarim4的16S rRNA基因克隆測序結果上傳至GenBank(登錄號為JX44467)，序列大小為1 474 bp。將序列進行BLAST比對，再用MEGA5.0的Neighbor-jioning構建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖3可以看出，與該菌株嗜鹽古菌鈉線菌Natrinema屬處于個分支。16S rRNA測序結果與有效發(fā)表的參比菌株鈉線菌屬Natrinema pallidum相似度為97%，為一個潛在新物種。

2.3.2 DNA的G+C mol% 含量測定。菌株tarim 4的基因組DNA中G+C含量為63.1%，相近菌株Natrinema pallidumG+C含量為63.1%，Natrinema altunense的G+C含量為63.1%。它們均屬于高G+C的革蘭氏陰性菌。

2.4 酶的純化檢測

2.4.1 微孔板法初篩堿性磷酸酶產(chǎn)生菌。采用磷酸苯二鈉比色法，從實驗室保存的86株極端嗜鹽古菌篩選出具有堿性磷酸酶活性的菌株為8株(部分菌株)。經(jīng)酶活測定，確定酶活力最高且較穩(wěn)定的菌株為tarim4，故選該菌株進一步研究。

2.4.2 堿性磷酸酶的分離、純化。經(jīng)過硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過濾層析、純化后的蛋白的SDS-PAGE電泳圖出現(xiàn)單一條帶，分子量約為45 kDa(圖4)。

3 討論

嗜鹽微生物生長于高鹽環(huán)境，根據(jù)其鹽濃度不同可分為低度嗜鹽、中度嗜鹽、高度嗜鹽。一般，鹽濃度5% ～20%的為中度嗜鹽微生物，大于20%的為極端嗜鹽微生物。大量研究表明，嗜鹽蛋白存在大量的酸性氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸，大量的鈉離子存在更有利于其肽鏈的折疊且維持其活性［9］。堿性磷酸酶來源非常廣泛。到2013年，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)約已存入66個堿性磷酸蛋白晶體結構圖，并且在物種之間磷酸蛋白酶的氨基酸序列同源性很低(30%)，但其四級結構極大相似。Arai等［10］從中度嗜鹽細菌鹽單胞菌Halomonassp.593得到堿性磷酸酶蛋白晶體結構，并且從結構上分析該酶能在1～4 mol/L NaCl濃度范圍都能發(fā)揮活性的原因。

該研究前期從硝爾庫勒鹽湖土樣分離菌株，土樣總鹽為293 g/L，分離培養(yǎng)基中添加NaCl濃度達20%(W/V)。在堿性磷酸酶篩選過程中，選用的也是同一鹽濃度。在86株嗜鹽古菌中只篩到8株產(chǎn)堿性磷酸酶菌株，只有1株高產(chǎn)菌株。導致這個酶活篩選低的原因可能有兩點:①磷酸苯二鈉檢測在該試驗中檢測靈敏度過低;②培養(yǎng)條件，有文獻報道低濃度磷能誘導堿性磷酸酶的表達。該酶活性被胞內(nèi)磷和胞外磷的濃度進行調(diào)節(jié)［4］。但是，在培養(yǎng)過程中，沒有考慮到人工設計一個無磷或低磷環(huán)境。因此，無法判斷這些保存的菌體是否能產(chǎn)堿性磷酸酶。靈敏的檢測手段和無磷的培養(yǎng)條件將是我們繼續(xù)開展堿性磷酸酶分離和純化非常關鍵的步驟。

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