林 敏，李洪濤，2* ，許修宏，李思琦

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

堆肥是通過微生物對(duì)有機(jī)物的分解完成有機(jī)物無機(jī)化，同時(shí)微生物實(shí)現(xiàn)自身的增值［1］。我國北方以牛糞為原料的堆肥生產(chǎn)較為常見，但利用合適的外源微生物菌劑來提高堆肥質(zhì)量尚是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。在堆肥中的有機(jī)質(zhì)中，木質(zhì)纖維素屬于難降解的部分。它的降解與否限制堆肥的腐熟。添加菌劑可以改變堆肥中各種微生物的數(shù)量和種類，使得木質(zhì)纖維素降解加速，堆肥提早進(jìn)入腐熟。許修宏等［2］利用牛糞和稻草共發(fā)酵的研究表明，添加外源微生物使堆肥中的纖維素酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶均有所增加。

β-葡萄糖苷水解酶很廣泛地存在于自然中。它可以來源于微生物、植物及動(dòng)物，其中微生物來源較多［3-4］。不同微生物的β-葡萄糖苷水解酶按其分子結(jié)構(gòu)特征分屬為配糖水解酶家族1(GH1)和配糖水解酶家族3(GH3)兩類［5］。同一家族中的β-葡聚糖苷酶基因同源性較高。

通過設(shè)計(jì)β-葡萄糖苷水解酶GH1和GH3家族的通用簡并引物，采用PCR-DGGE技術(shù)，筆者探究了堆肥過程中不同時(shí)期相應(yīng)功能性微生物群落的組成及其分布的變化，為進(jìn)一步揭示與闡明添加外源菌劑對(duì)纖維素基質(zhì)代謝的功能性微生物類群及其作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 堆肥材料與試驗(yàn)方法 采用自然通風(fēng)堆肥的方式對(duì)牛糞、稻草秸稈進(jìn)行好氧堆肥試驗(yàn)，堆肥初始C/N比為30，含水率為60%。試驗(yàn)地點(diǎn)在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站。設(shè)置堆體高1 m，直徑約1 m，呈垛形。堆料分A、B組，其中A組為對(duì)照樣，進(jìn)行自然堆肥;B組添加菌劑DN-1(由許修宏老師實(shí)驗(yàn)室制，包括研究木質(zhì)素降解的模式菌株——黃孢原毛平革菌，兼具木質(zhì)素、纖維素、半纖維素3種酶活性的灰略紅鏈霉菌C-5，從堆肥中分離得到的具有木質(zhì)纖維素降解能力且能使堆肥快速升溫的3株芽孢桿菌)。采用固態(tài)接種體，濃度為1×109CFU/g，接種量為10 g/kg，邊建堆邊添加菌劑，接種后均勻混合堆體材料。

1.2 β-葡萄糖苷水解酶活性的測(cè)定 利用固相酶活測(cè)定方法，檢測(cè)堆肥樣本的酶活。取堆肥樣品，真空冷凍干燥處理后，-80℃保存?zhèn)溆谩＆?葡萄糖苷水解酶反應(yīng)的底物為對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，用對(duì)硝基苯酚溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性反應(yīng)監(jiān)測(cè)時(shí)間為0、7、14、21 min，酶活反應(yīng)溫度50℃，測(cè)定400 nm波長吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，求得測(cè)試液中相應(yīng)的還原糖的量，計(jì)算酶活力［5］。

式中，c為15 ml測(cè)試液中轉(zhuǎn)化的還原糖量，mg;V為定容體積，m;m為試樣質(zhì)量，g;V1為吸取酶液的體積，ml;t為水解時(shí)間，min。

1.3 采樣與堆肥樣品總DNA的提取 試驗(yàn)分別在堆肥發(fā)酵的第 0、1、3、6、9、12、15、18、19、22、24、28、31、46 天，分上、中、下層隨機(jī)取樣。分別在距堆體頂端30、60、80 cm處分五點(diǎn)采集樣品，取得的樣品混合均勻，采取四分法保留200 g，用保鮮袋密封，-20℃冷凍保存，以備分析、測(cè)定用。取10 g樣品，加入滅菌的三角瓶中，加入10 ml滅菌的ddH2O于搖床中，轉(zhuǎn)速為140 r/min，2 h;將搖勻的樣品倒入10 ml離心管中，轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，離心5 min，取上清，重復(fù)一次此步驟;再倒入新的10 ml離心管中，10 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體，沉淀作為樣品。然后，取0.3～0.5 g沉淀樣品。利用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒提取樣品總DNA，提取方法按試劑盒使用說明進(jìn)行操作。

1.4 目的基因的擴(kuò)增 GH3家族目的基因片段所用到的引物見表1。PCR采用50 μl反應(yīng)體系:10×PCR緩沖液;5 μl脫氧核糖核苷酸(dNTP);引物(10 μmol/L)1 μl;1 μl DNA;1 UDNA聚合酶;4 μl濃度1%牛血清白蛋白(BSA);補(bǔ)足滅菌的 ddH2O 至 50 μl。

GH3家族真菌16S rDNA PCR擴(kuò)增條件為:94℃5 min;94℃ 50 s，57.4℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72℃10 min;4℃ 59 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥過程中溫度的變化 溫度是影響堆肥中微生物活性的最顯著因子，是堆肥工藝的一個(gè)重要物理參數(shù)，也是影響酶活的主要因素。從圖1可以看出堆體溫度的總體變化趨勢(shì)，主要是升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期4個(gè)過程。

表1 試驗(yàn)用到的引物

溫度是影響微生物生長的重要因素。溫度變化能很好地反映堆肥的進(jìn)程。由圖1可知，添加菌劑的堆肥在第3天進(jìn)入高溫期(＞60℃)，高溫期持續(xù)20。自然堆肥雖然也在第3天進(jìn)入高溫期，但溫度僅為45℃，且高溫期僅持續(xù)14 d，高溫期的平均溫度低于菌劑堆肥。由此可見，加入菌劑可延長堆肥的高溫期，提高堆體溫度，促進(jìn)堆肥腐熟。在堆肥腐熟后期，有機(jī)物的量大大減少，微生物在分解過程中無法產(chǎn)生足夠的熱量，使得溫度呈連續(xù)下降趨勢(shì)，直至堆肥結(jié)束。

2.2 β-葡萄糖苷水解酶酶活性的變化 由圖2可知，在堆肥初期(0 d)，自然組堆肥和菌劑組堆肥β-葡萄糖苷水解酶活性別分別是0.54和0.48 U/L。在堆肥的前期也就是升溫期(0～3 d)2種處理的β-葡萄糖苷水解酶活性均開始提高，期間自然組均高于菌劑組。在堆肥12 d，β-葡萄糖苷水解酶活性降到最低，隨后急劇升高，菌劑組在堆肥18 d達(dá)到最高，而自然組在堆肥22 d達(dá)到最高，在此期間菌劑組β-葡萄糖苷水解酶活性均高于自然堆肥組。在堆肥20 d之后，堆肥進(jìn)入降溫腐熟期，2種處理的β-葡萄糖苷水解酶活性均開始降低，直到堆肥結(jié)束。在此期間自然組β-葡萄糖苷水解酶活性均略高于菌劑處理組。

2.3 PCR-DGGE分析相關(guān)微生物群落的組成及其演替 由圖3可知，GH3家族真菌DGGE圖譜微生物的多樣性較高。在堆肥的升溫期和高溫前期(0～6 d)，自然組和菌劑組均沒有檢測(cè)到相應(yīng)真菌。在自然堆肥過程中，堆肥達(dá)到高溫階段第8 天左右，A3、B3、C3、I3、E3、C3 等菌株開始陸續(xù)出現(xiàn)，此時(shí)微生物群落多樣性達(dá)到最大值。在堆肥20 d之后進(jìn)入降溫期，A3菌消失，D3菌開始出現(xiàn)，一直持續(xù)到31 d堆肥結(jié)束。與自然堆肥相比，菌劑組的微生物多樣性相對(duì)較少，真菌的種類也不及自然堆肥。在堆肥6～20 d整個(gè)高溫期，只有H3、E3、F3、C34種真菌被檢測(cè)到，隨著堆肥化進(jìn)程到達(dá)降溫期(20～31 d)，除F3外的另外3種真菌均沒有再出現(xiàn)。待堆肥結(jié)束進(jìn)入腐熟期(31 d)，菌劑組堆肥能檢測(cè)到的真菌只有J3、F3、D3。在整個(gè)堆肥進(jìn)程中，自然組堆肥GH3家族真菌的多樣性均高于菌劑組堆肥。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 對(duì)β-葡萄糖苷水解酶基因GH3家族真菌群落的DGGE圖譜進(jìn)行分析。由圖4可知，A3與Thermoascus aurantiacusst(JN121818)同源性高達(dá)92%，B3與Kluyveromyces marxianus(P07337)的同源性為70%，C3與Trichoderma reesei(KF979307)同源性為83%，D3與Aspergillus niger(Q9P8F4)同源性為83%，E3與Penicillium brasilianum(EF527403)相似性高達(dá)97%，F(xiàn)3與Aspergillus aculeatinus(KJ775261)同源性為 91%，G3則與Hypocrea lixii T7(EF426299)相似性達(dá)到86%。

A3菌屬于嗜熱子囊菌，出現(xiàn)在自然堆肥的高溫期，溫度降到40℃以下，檢測(cè)不到該菌的存在。B3屬于馬克思克魯維酵母，出現(xiàn)在自然堆肥12～20 d。酵母也是真菌中產(chǎn)β-葡萄糖苷水解酶的一個(gè)主要物種。C3為里氏木霉，屬于好氧菌，是纖維素酶的主要生產(chǎn)菌，在堆肥的各個(gè)時(shí)期幾乎都有出現(xiàn)。D3、F3均為曲霉屬，出現(xiàn)在兩種堆肥處理的中后期。E3為青霉菌，屬于青霉屬，出現(xiàn)在自然堆肥的降溫期和菌劑堆肥的高溫期，屬于好氧的纖維素分解菌。G3為哈茨木霉屬，只出現(xiàn)在自然堆肥的中后期。在堆肥過程中，GH3真菌家族分解纖維素的能力較強(qiáng)。優(yōu)勢(shì)菌種主要是木霉屬和曲霉屬。

3 結(jié)論與討論

在堆肥0～6 d，溫度快速升高，堆體溫度上升到60℃(菌劑組75℃)。兩種處理堆肥中β-葡萄糖苷水解酶活性都呈現(xiàn)略微上升的趨勢(shì)。在此期間糖類蛋白質(zhì)等大分子化合物被微生物分解利用，產(chǎn)生相應(yīng)的能量，并且提高堆肥的溫度。從微生物多樣性來看，GH3家族真菌群落在兩種處理堆肥中均沒有被檢測(cè)到，說明此時(shí)影響兩種酶活性變化的主要是細(xì)菌。初步可以推斷，GH3真菌家族在堆肥早期階段發(fā)揮的作用并不明顯。

在堆肥的高溫前期(6～12 d)，兩種處理堆肥的溫度均穩(wěn)定在60℃左右，微生物種類和數(shù)量變化較頻繁，酶活性也出現(xiàn)相應(yīng)的變化，其中菌劑組β-葡萄糖苷水解酶活性高于自然組堆肥。這表明菌劑處理組纖維素的分解速率要高于對(duì)照組。不同處理纖維素酶活性都呈下降的趨勢(shì)，可以推斷此期間纖維素的降解率并不高。兩種不同處理堆肥的GH3真菌家族豐富程度不斷提高，其中自然堆肥組微生物多樣性要高于菌劑組堆肥。

當(dāng)堆肥進(jìn)入高溫后期(12～20 d)，溫度依舊維持在45℃(菌劑組50℃)以上。纖維素酶活性呈現(xiàn)急劇上升的趨勢(shì)，并在18 d達(dá)到峰值，此期間纖維素類物質(zhì)開始被大量分解。菌劑處理組纖維素酶活性遠(yuǎn)高于自然堆肥組，說明菌劑組堆肥在高溫后期纖維素的降解速率高于自然組堆肥。從微生物群落多樣性來看，GH3真菌物種豐富度不斷增強(qiáng)，在12 d左右達(dá)到最高值，自然堆肥微生物多樣性要高于菌劑組堆肥。真菌種數(shù)的增加以及同時(shí)期纖維素酶活性的提高，可以推斷出真菌數(shù)量的增加是提高纖維素酶活性的主要原因。

在堆肥20 d之后進(jìn)入降溫期，溫度開始下降，最后趨于環(huán)境溫度。纖維素酶活性也不斷下降，表明纖維素的分解速率開始逐漸變慢。此期間真菌種類有所下降。待堆肥化完成進(jìn)入腐熟期(31 d)，溫度接近于環(huán)境溫度，纖維素酶活性的降低也有所減緩，微生物種類和數(shù)量也趨于穩(wěn)定。這與Li等［6］研究結(jié)果相一致。

由此可知，接種菌劑堆肥進(jìn)入高溫階段的速度比自然堆肥更快，并且最高溫度也較高。在堆肥過程中，纖維素酶活性的變化呈“幾”字型變化，高溫期酶活性較高。在堆肥的升溫期和高溫期(0～20 d)，菌劑組堆肥β-葡萄糖苷水解酶活性均高于自然堆肥組。在堆肥各時(shí)期，菌劑組堆肥GH3細(xì)菌家族微生物多樣性均低于自然堆肥組。堆肥的中后期真菌是主要的纖維素降解。優(yōu)勢(shì)菌種是GH3真菌家族的木霉屬和黑曲霉屬。

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