楊浩　刁治民　梁洪興

（1.青海師范大學生命與地理科學學院，青海 西寧 810008； 2.重慶市合川區(qū)瑞山中學，重慶 合川 401520）

分子生物技術(shù)在污水處理系統(tǒng)內(nèi)硝化菌群研究中的應用

楊浩1刁治民1梁洪興2

（1.青海師范大學生命與地理科學學院，青海 西寧 810008； 2.重慶市合川區(qū)瑞山中學，重慶 合川 401520）

分子生物技術(shù)近幾年來得到了飛速發(fā)展，廣泛應用于環(huán)境微生物的研究，本文詳細介紹了最近幾年研究人員在熒光原位雜交技術(shù)和聚合酶鏈式反應技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的幾種新技術(shù)，并分析了這些技術(shù)的應用現(xiàn)狀，對分子生物技術(shù)的發(fā)展做出了展望，希望能為污水處理系統(tǒng)穩(wěn)定運行提供參考。

分子生物技術(shù)；硝化菌群；污水生物處理；熒光原位雜交

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，污水生物處理系統(tǒng)也隨這發(fā)生了改進。污水生物脫氮是污水處理中最重要的環(huán)節(jié)，共包括兩個階段：硝化和反硝化。硝化階段主要利用硝化菌進行處理，如氨氧化菌（AOB）、亞硝酸鹽氧化菌（NOB）等。其中AOB可以將NH4+-N氧化成NO-2-N，NOB可以將NO-2-N氧化呈NO3-N。保證硝化細菌的存活和穩(wěn)定繁殖是污水生物脫氮的關(guān)鍵所在。所以，利用分子生物技術(shù)對硝化細菌的活性、分布等進行研究，可有效促進污水脫氮系統(tǒng)的穩(wěn)定與發(fā)展。目前，應用最多的分子生物技術(shù)是FISH技術(shù)（熒光標記的原位雜交）與PCR技術(shù)（聚合酶鏈式反應）。

1　基于FISH技術(shù)的分析方法

FISH技術(shù)是一種非放射性原位雜交技術(shù)。FISH的原理是檢測目標微生物RNA的特殊序列，制作出相對應的核酸探針，并將其與目標微生物進行原位雜交，然后利用CLSM（共聚焦激光掃描顯微鏡）對微生物進行分析。如圖1所示：

圖1　

FISH技術(shù)可以檢測污水中的絲狀菌、聚磷菌、硝化菌等，隨著研究的深入，人們對FISH技術(shù)進行了改進，研究出了如下幾種技術(shù)：顯微放射自顯影FISH技術(shù)（FISH-MAR）、微電極FISH技術(shù)（FISH-microelectrodes）以及Clone-FISH技術(shù)。

1.1顯微放射自顯影FISH技術(shù)

使用單一的FISH技術(shù)無法采集微生物的生理信息，使用單一的顯微放射自顯影技術(shù)則不能識別細菌的分布。而當這兩種技術(shù)被結(jié)合后，則能夠通過照片的方式將細菌的結(jié)構(gòu)、分布等清晰地展現(xiàn)出來，并且能夠區(qū)分不同細菌的活性。

首先將需要分析的微生物進行培養(yǎng)，使其吸收底物中的放射性物質(zhì)，通過放射自顯影可以清晰地看到吸收了放射性物質(zhì)的細胞（MAR+，呈黑色）。培養(yǎng)底物分為有機底物和無機底物，有機底物通常用14C進行標記，如14C-乙酸等；而無機底物一般使用NaH14CO3。研究人員在對顯微放射自顯影FISH技術(shù)研究時，先將硝化生物膜在無機物底物中培養(yǎng)6h，硝化菌中有呈MAR+的硝化自養(yǎng)菌與呈MAR-的異養(yǎng)菌，之后將這些細菌放入只含的底物中培養(yǎng)10h，大部分異養(yǎng)菌都呈MAR+。這個實驗表明，異養(yǎng)菌可以通過14C來標記自養(yǎng)菌的代謝產(chǎn)物，使人們了解了在碳源不足時自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的相互關(guān)系。研究結(jié)果表明，碳源不足時，自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌比例均為50%，這其中α-Proteobacteria占23%，γ-Proteobacteria占13%，Cytophaga Flavobacterium Bacteroides占2%，非硫細菌占9%，其他細菌占3%。

FISH-MAR雖然能夠直觀地對微生物結(jié)構(gòu)、分布、代謝展開研究，但是對于細菌含量較低的物質(zhì)卻不適用此方法。因此，如果硝化菌中沒有集中的菌落時，利用該方法將不能得到較好的檢測結(jié)果。

1.2微電極FISH技術(shù)

微電極FISH技術(shù)可以檢測污水生物生物膜內(nèi)部的環(huán)境要素變化，進而檢測出微生物的活性。利用微電極FISH技術(shù)可以清晰地了解微生物分布、代謝、環(huán)境三者之間的關(guān)系。微電極FISH技術(shù)主要測量O2、H2S、NO3、NH4+以及PH等。

研究人員利用微電極FISH技術(shù)對自養(yǎng)硝化菌生物膜和污水生物生物膜中氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌的分布進行了研究。實驗結(jié)果表明，亞硝酸菌（nitrosomonas）優(yōu)勢是氨氧化菌，而硝化螺旋菌（Nitrospira-like）優(yōu)勢是亞硝酸鹽氧化菌，沒有硝化細菌（nitrobacter）。利用微電極FISH技術(shù)能較好地分析生物擴增（人工投入培養(yǎng)的硝化菌，增加硝化菌數(shù)量及活性）和生物刺激（投入培育底物達到對硝化菌生長的促進或抑制）對污水生物生物膜硝化的影響。曾經(jīng)有專家想要通過增加培養(yǎng)底物中NH4+和NO2-來促進氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌的生長，但結(jié)果卻適得其反，NO2-的氧化效果不僅沒有增強，氨氧化菌的生長反而受到了抑制。

1.3Clone-FISH技術(shù)

用克隆的方法克隆出與檢測物有同種基因片段的Clones（克隆子），與FISH技術(shù)結(jié)合就成了Clones-FISH法，此方法可應用在如下兩個方面：①檢測核酸探針的有效性。②利用FISH技術(shù)檢驗克隆子中是否具有與檢測物相同的基因片段。

2　基于PCR技術(shù)的分析方法

在以往的檢測方法中，人們通常是從污水中提取硝化菌，但這種硝化菌的DNA含量很低，為檢測工作帶來了很大麻煩。而PCR技術(shù)能夠大量擴增DNA片段，從而解決了上述問題。

2.1amoA基因與16SrRNA基因

如果想要實現(xiàn)硝化菌DNA序列的擴增，首先應提取一段硝化菌帶有進化標記的DNA序列，找出該序列的保守區(qū)，制作出與之匹配的探針。氨氧化菌的帶有進化標記的基因一般是amoA基因與16SrRNA基因。

2.1.1amoA基因

amoA基因是編碼氨單加氧酶的一種基因，編碼氨單加氧酶是氨氧化菌獨有的胞內(nèi)酶，共有三個基因，分別是amoA、amoB、amoC，而amoA中含有編碼氨單加氧酶的活性位點能夠?qū)@催化成羥胺，為氨氧化菌的成長供應能量。一個氨氧化菌中含有2～3個amoA，不同的amoA功能也不一樣。

2.1.216SrRNA基因

研究人員對16SrRNA基因的研究具有劃時代的意義，增加了人們對微生物生長的認識。16SrRNA基因有很強的保守性，根據(jù)微生物中16SrRNA基因的不同可以將微生物分為兩類，古細菌和細菌。許多書籍中對微生物的命名都是根據(jù)不同的16SrRNA基因分析的。一個氨氧化菌中只有一條16SrRNA基因，而不同的氨氧化菌的16SrRNA基因也不完全相同，從這些差異中可以看出不同氨氧化菌的關(guān)聯(lián)與進化差異。

有關(guān)專家對不同氨氧化菌中的amoA基因和16SrRNA基因的排列順序進行研究后發(fā)現(xiàn)，大部分氨氧化菌的amoA基因或16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹都比較相似，正是由于這一相似性，導致用16SrRNA基因制作的探針檢測的精確度受到影響。而amoA由于只在氨氧化菌中存在，盡管它對系統(tǒng)發(fā)育樹影響不大，但由于它的差異性使得利用amoA基因制作的探針精確性與特異性比16SrRNA基因要強，能準確地辨別氨氧化菌的種屬。目前，這兩種探針都只能在自養(yǎng)型氨氧化菌中使用，而無法對實際污水中種群的多樣性進行分析。

2.2PCR-變性梯度凝膠電泳克隆測序技術(shù)

PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)是將利用PCR技術(shù)擴增的DNA片段植入到凝膠中進行電泳的一種技術(shù)。凝膠一般是聚丙烯酰胺凝膠，且加入了梯度變性劑，一般是尿素和甲酰胺。利用PCR技術(shù)擴增的DNA片段長度是可控的，可以保證長度的一致性，但是DNA內(nèi)部的堿基排列卻有所不同。在進行電泳時，不同的堿基排列會根據(jù)梯度變性劑濃度的變化而發(fā)生變性，電泳速度越來越慢，最終各自停留在相應的位置，之后在對其進行染色，凝膠上就會出現(xiàn)若干條DNA譜帶，一條譜帶就是一個DNA片段。而這種方法經(jīng)常會受到單鏈DNA、探針特異性等的影響，導致檢測結(jié)果不準確。為了避免這一影響因素，研究專家經(jīng)常會在測驗后再進行Cloning（克?。┖蚐equencing（測序），以對檢測結(jié)果進行進一步確認，即所謂的PCR-DGGE-cloning-sequencing（PCR-變性梯度凝膠電泳克隆測序技術(shù)）。

研究人員利用此技術(shù)對污水處理系統(tǒng)內(nèi)硝化菌群進行了研究，發(fā)現(xiàn)在污水處理過程中，氨氧化菌的數(shù)量是不會改變的。但是若受到外界因素（如溫度、水質(zhì)）的影響，氨氧化菌的種群結(jié)構(gòu)會發(fā)生較大的改變。研究人員在研究曝氣對污水中硝化細菌的結(jié)構(gòu)與脫氮效率造成的影響時注意到，供氧時間的長短對污水中硝化菌的種群結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生一定的影響。經(jīng)過研究，脫氮效率與氨氧化菌的含量以及種群多樣性并無關(guān)系。

利用PCR-變性梯度凝膠電泳克隆測序技術(shù)能夠清晰的展示污水處理中硝化菌的種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化。然而，凝膠中DNA片段的堿基對一般不超過500，這一片段的序列又要與檢測序列的重合度大于85%，否則就不能對硝化菌進行準確的分類，無法收集有關(guān)硝化菌的數(shù)據(jù)。另外，此技術(shù)的靈敏度不高，凝膠配置濃度不容易掌握，導致此技術(shù)對微生物含量少的種群沒有理想的檢測能力。

3　結(jié)論與展望

3.1分子生物技術(shù)從細微層面研究了影響污水處理系統(tǒng)中硝化菌生長的條件，文中所提到的脫氮技術(shù)應得到大力發(fā)展，例如：硝化、反硝化、短程脫氮、氨氧化等。脫氮技術(shù)能夠?qū)Σ煌⑸锓N群的代謝加以識別，反映出微生物種群變化與污水處理系統(tǒng)設(shè)置參數(shù)的關(guān)系，從而更快速、更精準的做出一些改變，對污水處理系統(tǒng)能夠穩(wěn)定運行有深刻的影響及指導作用。

3.2在未來的發(fā)展中，應完善分子生物技術(shù)研究時的具體操作流程，積極引進新技術(shù)、新方法，提高檢測的準確性以及特異性，如FISH-MAR、Clone-FISH、同位素探測等方法的操作流程應進一步完善，加強對核酸探針和引物的改進，使其能更精確地反映出微生物種群活性與外界環(huán)境的關(guān)系。相信在未來的污水處理中，分子生物技術(shù)會隨著科技的進步，研究方法更方便快捷，在對污水處理系統(tǒng)的檢測中更為穩(wěn)定、精確，還可以為運行研發(fā)實時監(jiān)測生物反應器提供技術(shù)引導。

［1］李磊，曾薇，張悅，楊瑩瑩.分子生物技術(shù)在污水處理系統(tǒng)內(nèi)硝化菌群研究中的應用［J］.應用與環(huán)境生物學報，2010（1）：135-142.

［2］朱文優(yōu)，張忠剛.分子生物學技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應用［J］.宜賓學院學報，2009（6）：88-90.

［3］王曉丹，李艷紅.分子生物學方法在水體微生物生態(tài)研究中的應用［J］.微生物學通報，2012（4）：777-781.

［4］臧藝鵬，李悅，曲洋，等.固定化微生物技術(shù)——載體截留法在污水生物處理中的研究應用［J］.科技信息，2010（7）：355-356.

Application of Molecular Biological Technology in the Study of the Nitrification Bacteria in Wastewater Treatment System

Yang Hao1Diao Zhimin1Liang Hongxing2
（1.School of Life and Geographical Sciences，Qinghai Normal University，Xining Qinghai 810008；2.Chongqing Hechuan Quruishan Middle School，Hechuan Chongqing 401520）

Molecular biological technology has been rapid developedin recent years，widely used in the studyof en?vironmental microbiology，this paper introduces severalnew technologies developedin recent years by researchers based on fluorescence in situ hybridizationtechnology and polymerase chain reaction technology in detail，and ana?lyzes the running state ofthese technologies，makes a prospect for the development of molecular biological technol?ogy，hoping toprovide reference for the stable operation of sewage treatment system.

Molecular biologicaltechnology；Nitrification bacteria；Wastewater biological treatment；Fluorescencein situ hybridization

X703

A

1003-5168（2015）05-0125-3

2015-4-23

楊浩（1993.9-），男，本科在讀，研究方向：生物科學。