李菁菁，葉　潤(rùn)，崔亞娟，*，李全霞，李　東，路　勇，張衛(wèi)民，黃　華，趙茜茜

（1.北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京100069；2.北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京100041）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定配方奶粉中泛酸、生物素和氰鈷胺素

李菁菁1，葉潤(rùn)1，崔亞娟1，*，李全霞1，李東1，路勇2，張衛(wèi)民2，黃華2，趙茜茜2

（1.北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京100069；2.北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京100041）

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定配方奶粉中泛酸、生物素和氰鈷胺素的方法。樣品經(jīng)水溶超聲提取、三氯甲烷除蛋白后，進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，采用HSS T3液相色譜柱分離，以10mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧-正離子電離源多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果表明：泛酸（VB5）的方法定量限為5μg/100g，生物素（VB7）為2μg/100g，氰鈷胺素（VB12）為0.2μg/100g；回收率為79.4%～87.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～5.3%。泛酸的線性范圍0.5～1000ng/mL，生物素為0.2～10ng/mL，氰鈷胺素為0.02～10ng/mL。該方法分析操作簡(jiǎn)單、速度快、靈敏度高、重復(fù)性好，適用于配方奶粉中泛酸、生物素和氰鈷胺素的同時(shí)測(cè)定。

泛酸，生物素，氰鈷胺素，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，奶粉

泛酸（Pantothenic acid，VB5）、生物素（Biotin，VB7）、氰鈷胺素（Cyanocobalamin，VB12）是配方奶粉中必須添加的維生素，對(duì)嬰幼兒快速發(fā)育的各種組織和器官具有十分重要的作用［1］。其含量均較低，尤其是生物素和氰鈷胺素含量通常以微克來(lái)表示。

目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)配方奶粉中泛酸的檢測(cè)方法是微生物法和高效液相色譜法［2］。其中，微生物法［3-5］是測(cè)定泛酸的經(jīng)典方法，但是該方法復(fù)雜費(fèi)時(shí)，并對(duì)環(huán)境條件要求高，影響因素多，且重復(fù)性稍差。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)生物素、氰鈷胺素的檢測(cè)方法采用微生物法［6-7］，具有相類(lèi)似的問(wèn)題。高效液相色譜法［8-12］樣品前處理復(fù)雜，且雜質(zhì)峰干擾多，測(cè)定基質(zhì)干擾大、靈敏度低，應(yīng)用受到限制。國(guó)內(nèi)外利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［13-17］同時(shí)測(cè)定泛酸、生物素、氰鈷胺素單種或其中2種的相關(guān)研究已有報(bào)道。

本研究采用基質(zhì)加標(biāo)法，可以排除樣品基質(zhì)的干擾，保證了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）實(shí)現(xiàn)奶粉中泛酸、生物素、氰鈷胺素的同時(shí)測(cè)定，是一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的分析方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

奶粉市售配方奶粉；泛酸（VB5，CAS：79-83-4）、生物素（VB7，CAS：58-85-5）、氰鈷胺素（VB12，CAS：68-19-9）純度均大于99.5%，美國(guó)IsoSciences公司；甲酸、乙酸銨（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司；乙醇、乙腈、三氯甲烷（均為色譜純） 美國(guó)Fisher公司；實(shí)驗(yàn)用水超純水。

Acquity@UPLC-Xevo TQ型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)Waters公司；Acquity@HSS T3色譜柱美國(guó)Waters公司；高速冷凍離心機(jī)日本HITACHI公司；漩渦振蕩器美國(guó)Scientific Industries公司；分析天平德國(guó)Sartorius公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1溶液配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：精確稱(chēng)取泛酸鈣、生物素、氰鈷胺素標(biāo)準(zhǔn)品適量（精確至0.01mg）用水溶解，配制成100μg/mL的混合儲(chǔ)備液，冷藏避光保存3個(gè)月。臨用時(shí)，用水稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液，經(jīng)0.22μm GHP濾膜過(guò)濾，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.2.2樣品處理稱(chēng)取樣品1.0g于50mL離心管中，加入10mL水。渦旋振蕩1min，超聲10min。加入10mL三氯甲烷，渦旋振蕩1min，10000r/min離心10min。上清液用超純水適當(dāng)稀釋?zhuān)?jīng)0.22μm GHP濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

1.2.3基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)提取前加標(biāo)處理：稱(chēng)取樣品1.0g于50mL離心管中，分別加入3個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后加入10mL水溶解。其后處理同1.2.2。

提取后加標(biāo)處理：取1.2.2中的上清液1mL于10mL容量瓶中，分別加入3個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

通過(guò)比較提取前加標(biāo)樣品峰面積（A前）和提取后加標(biāo)樣品峰面積（A后）得到回收率，扣除了基質(zhì)效應(yīng)，回收率計(jì)算公式如下：

1.2.4色譜條件液相系統(tǒng)：Acquity UPLC系統(tǒng)；色譜柱：Waters Acquity HSS T3柱（1.0mm×100mm，1.8μm）；流速：0.2mL/min；柱溫：40℃；樣品溫度：15℃；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相A：10mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

1.2.5質(zhì)譜條件質(zhì)譜系統(tǒng)：Xevo TQ MS；離子化：ESI+；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：2.3kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：500℃；錐孔氣流量（氮?dú)猓?0L/h；脫溶劑氣流量（氮?dú)猓?000L/h；碰撞氣流速（氬氣）：0.17mL/min。3種維生素的定量和定性離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表2。

表1　流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1　Elution condition of the thirteen sedatives

表2　3種維生素的定性和定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量Table 2　Confirmation and quantitative ions，cone voltages and collision energies of the three vitamins

2　結(jié)果與分析

2.1提取條件選擇

針對(duì)泛酸、生物素、氰鈷胺素既能溶于水，又能微溶于乙醇的性質(zhì)，分別用水、10mmol/L乙酸銨和乙醇作為樣品提取溶劑作為提取劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：選擇乙醇作為提取劑，可同時(shí)提取出奶粉中的其他有機(jī)物質(zhì)，增加了基質(zhì)的干擾；選擇水和10mmol/L乙酸銨作為提取劑，靈敏度高、峰形穩(wěn)定，效果最好?？紤]到盡量簡(jiǎn)化提取操作的原則，選擇水作為提取劑。

另外，針對(duì)奶粉樣品中高蛋白的特性，分別考察了高氯酸和三氯甲烷的去除蛋白效果。結(jié)果表明，2種方式都可以使蛋白沉淀，獲得澄清的樣品溶液。但高氯酸對(duì)3種生物素的破壞性較大，處理后樣品的響應(yīng)值明顯下降。而三氯甲烷對(duì)回收率無(wú)明顯影響。因此選擇三氯甲烷作為除蛋白劑。

2.2基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)是樣品中除分析物以外的組分，對(duì)分析物的分析有顯著干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾被稱(chēng)為基質(zhì)效應(yīng)（ME）。LC-MS/MS中的基質(zhì)效應(yīng)由分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率所致，表現(xiàn)為離子增強(qiáng)或抑制作用［18］。

實(shí)驗(yàn)采用提取后添加法建立數(shù)學(xué)模型評(píng)定基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)（ME）=Set1/Set2，其中Set1：純的標(biāo)準(zhǔn)品溶液信號(hào)峰面積值，Set2：樣品基質(zhì)提取后添加信號(hào)峰面積值。2個(gè)條件下重復(fù)測(cè)定5次。結(jié)果表明ME值均＜60%，奶粉樣品中基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)不可忽略。

2.3色譜條件選擇

水溶性維生素通常很難在反相色譜柱上用常規(guī)的方法分離。本實(shí)驗(yàn)選用T3色譜柱，分別采用10mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）和純水、乙腈與甲醇作為流動(dòng)相，以不同比例梯度進(jìn)行洗脫。結(jié)果表明，流動(dòng)相選用10mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）和乙腈梯度洗脫，泛酸、生物素、氰鈷胺素達(dá)到較好的分離效果，出峰時(shí)間分別為2.21、2.67、2.49min。

2.4質(zhì)譜條件選擇

使用UPLC-MS/MS方法，通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式進(jìn)行采集，選擇目標(biāo)物質(zhì)的兩對(duì)母離子/子離子，其中響應(yīng)較強(qiáng)的離子對(duì)作為定量離子對(duì)，另一對(duì)作為定性離子對(duì)。3種維生素的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。在電噴霧源正離子檢測(cè)（ESI+）方式下，3種維生素的準(zhǔn)分子離子峰為［M+H］+峰。實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)各個(gè)參數(shù)得到響應(yīng)較強(qiáng)的［M+H］+母離子峰。然后對(duì)母離子進(jìn)行子離子掃描，調(diào)節(jié)碰撞能量。優(yōu)化確定適合本實(shí)驗(yàn)條件的質(zhì)譜條件，見(jiàn)表2。

圖1　3種維生素的定量離子色譜圖Fig.1　The quantification ion chromatogram of the three vitamins

2.5方法的驗(yàn)證

2.5.1回收率分別添加3個(gè)不同質(zhì)量濃度（表3）標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行提取測(cè)定，泛酸、生物素、氰鈷胺素的平均回收率分別為79.4%、84.8%、87.8%，RSD分別為4.4%、5.3%、3.3%。表明本法準(zhǔn)確性較好，適合配方奶粉中3種維生素的定量分析。

表3　3種維生素添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3　Average recoveries and relative standard deviation of the three vitamins（n=6）

2.5.2線性范圍、檢出限和定量限取1.2.2中的上清液1mL至10mL容量瓶中，添加100μL含3種分析物的已知濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水定容，進(jìn)樣分析。得到相關(guān)系數(shù)≥0.9985的較好線性關(guān)系，如圖2所示，泛酸的線性范圍0.5～1000ng/mL，生物素為0.2～10ng/mL，氰鈷胺素為0.02～10ng/mL。

圖2　3種維生素的校正曲線Fig.2　The calibration curve of the three vitamins

根據(jù)各定量離子3倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)樣品中的濃度得到方法檢出限，結(jié)果見(jiàn)表4。泛酸、生物素、氰鈷胺素檢出限分別為2、0.6、0.06μg/100g；以10倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)樣品中的濃度得到方法定量限，泛酸、生物素、氰鈷胺素定量限分別為5、2、0.2μg/100g。實(shí)驗(yàn)表明可以對(duì)3種維生素含量較低的樣品進(jìn)行定量分析。

表4　3種維生素的回歸方程、檢出限和定量限Table 4　Regression equations，limits of determination and limits of quantification of the three vitamins

2.5.3方法精密度取奶粉樣品按照1.2.2中的方法處理，平行測(cè)定6次（n=6），考察方法的精密度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。泛酸、生物素、氰鈷胺素測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.1%～5.1%，表明該方法精密度較好，適用于奶粉中低含量的生物素、氰鈷胺素的定量分析。

表5　3種維生素的測(cè)定結(jié)果Table 5　The result of determination of the three vitamins

3　結(jié)論

3.1以水溶解并超聲提取配方奶粉中的水溶性維生素，并采用三氯甲烷除去提取液中蛋白，用0.22μm GHP濾膜過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定。該操作簡(jiǎn)單，分析周期短，不需要復(fù)雜的前處理，得到了較好提取效果。

3.2通過(guò)基質(zhì)加標(biāo)法測(cè)定泛酸、生物素、氰鈷胺素等三種維生素，樣品回收率滿(mǎn)足要求，表明該方法可用于同時(shí)測(cè)定上述3種物質(zhì)的含量。本方法可替代使用價(jià)格昂貴的同位素內(nèi)標(biāo)法，降低中小企業(yè)的檢驗(yàn)成本。

3.3建立了超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定方法，采用電噴霧-正離子電離源多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定性和定量分析，將檢測(cè)時(shí)間控制在5min之內(nèi)，大大提高了檢測(cè)效率，值得推廣。

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Determination of pantothenic acid，biotin，cyanocobalamine in formula milk powder using ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry

LI Jing-jing1，YE Run1，CUI Ya-juan1，*，LI Quan-xia1，LI Dong1，LU Yong2，ZHANG Wei-min2，HUANG Hua2，ZHAO Xi-xi2
（1.Beijing Research Institute for Nutritional Resources，Beijing 100069，China；2.Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment，Beijing 100041，China）

Ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry（UPLC-TQMS）method had been developed for the determination for pantothenic acid（VB5），biotin（VB7），cyanocobalamine（VB12）in formula milk powder.The samples were ultrasonic extracted by water，and precipitated protein by chloroform for analyzing by UPLC-MSMS.The analytes were separated by HSS T3 column.The mobile phase consisted of 10mmol/L ammonium acetate with 0.1%formic acid and acetonitrile.The samples were identified and quantified by multiple reaction monitoring（MRM）via positive electrospray ionization（ESI+）.The results showed that the limit of quantification of VB5were 5μg/100g，VB7were 2μg/100g，VB12were 0.2μg/100g.The recoveries at three spiked levels and the relative standard deviations were 79.4%～87.8%and 3.3%～5.3%，respectively.This method was simple，time saving，sensitive and accurate in the determination of VB5，VB7，VB12in formula milk powder.

pantothenic acid；biotin；cyanocobalamine；ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry；milk powder

TS207.3

A

1002-0306（2015）12-0061-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.004

2015－02－02

李菁菁（1985-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程。

崔亞娟（1979-），女，碩士研究生，研究方向：分析與檢測(cè)。

北京市科學(xué)技術(shù)研究院青年骨干計(jì)劃（201315）；北京市科技計(jì)劃（Z141100002614013）。