孫肖園，張寶善，*，劉莎莎，羅　　騰，黃　　雯

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119；2.陜西省果蔬深加工技術(shù)研究中心，陜西西安710119；3.西北政法大學(xué)商學(xué)院，陜西西安710119）

柿單寧凝膠固定啤酒酵母菌發(fā)酵工藝研究

孫肖園1，2，張寶善1，2，*，劉莎莎1，羅騰1，黃雯3

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119；2.陜西省果蔬深加工技術(shù)研究中心，陜西西安710119；3.西北政法大學(xué)商學(xué)院，陜西西安710119）

目的：比較游離酵母菌、柿單寧凝膠固定的酵母菌和常用的海藻酸鈉PVA復(fù)合材料固定的酵母菌對發(fā)酵速度的影響，并探究柿單寧凝膠包埋的啤酒酵母菌對麥芽汁的最佳發(fā)酵條件。方法：從青牛心柿果中提取的柿單寧與交聯(lián)劑混合，包埋啤酒酵母菌，用柿單寧凝膠固定啤酒酵母菌對麥芽汁進行發(fā)酵，在單因素實驗的基礎(chǔ)之上，通過正交實驗研究發(fā)酵溫度、包埋量、pH和初始糖度對固定化酵母菌發(fā)酵的影響。結(jié)果：柿單寧凝膠固定的啤酒酵母菌與其他材料包埋的酵母菌相比，真實發(fā)酵度最高，達96.05%；最佳發(fā)酵條件為：包埋量10（包埋劑和酵母菌的體積比），麥芽汁初始糖度14%，pH為4.0，發(fā)酵溫度30℃，此條件下，真實發(fā)酵度可達97.2%。結(jié)論：制備柿單寧凝膠條件溫和，增大了包埋后酵母菌的活性，而且為這種材料的廣泛使用提供了可能。

柿單寧，凝膠，固定化酵母菌，發(fā)酵

啤酒酵母菌是釀造葡萄酒、啤酒和其他果酒最主要的酒精發(fā)酵菌種。包埋酵母菌常用的海藻酸鈉在含高濃度的磷酸鹽或在含有Mg2+、K+等陽離子溶液中形成的凝膠不穩(wěn)定、易破碎和溶解［1］；有機合成的高分子凝膠強度好，但大部分有毒性，另外它們形成的凝膠傳質(zhì)性能較差，在對細胞進行包埋的過程中因自身的毒性和凝膠交聯(lián)過程中會放熱降低酵母菌的活性。因此，研究和開發(fā)新的酵母菌固定材料和固定技術(shù)是十分必要的。

中國是澀柿的原產(chǎn)國，也是主產(chǎn)國，有豐富的柿資源。2013年我國的澀柿產(chǎn)量達460萬噸。其中產(chǎn)生落果、次果近100萬噸，這些果實得到不合理利用而造成資源的大量浪費。柿果含有豐富的單寧物質(zhì)，青柿果含單寧2%以上。單寧是一種天然高分子酚類化合物，自身可進行酚羥基的縮合反應(yīng)，產(chǎn)生凝膠，我國常用作木材膠黏劑、金屬絡(luò)合劑的栲膠、烤漆就是利用這一原理，從富含單寧的植物材料中提取單寧，再經(jīng)過縮合而形成膠團。另外，柿單寧的大量酚羥基與蛋白質(zhì)主鏈的氨基、羧基之間通過疏水和氫鍵作用也可發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生凝膠［2-3］。Inoue K等學(xué)者分別從柿果肉和柿皮中提取柿單寧，并與甲醛等聚合劑反應(yīng)制成凝膠，吸附廢水中的重金屬離子如Cr2+、Hg2+、Ni2+等，取得一定的研究成果［4-6］。廖學(xué)品等學(xué)者利用黑荊樹單寧與動物膠原蛋白作用制備凝膠吸附劑［7］。

本實驗以澀柿果為原料提取柿單寧，根據(jù)單寧自身的縮合性及和蛋白質(zhì)之間的膠凝作用，與明膠蛋白反應(yīng)，包埋啤酒酵母菌［8］。此方法與傳統(tǒng)方法相比較，安全、無毒，包埋率高，而且能最大程度的保持及提高酵母菌的發(fā)酵活力。本研究為柿單寧凝膠的制備、固定化啤酒酵母菌以及發(fā)酵工藝提供了新的技術(shù)參數(shù)，也為解決大量的澀柿落果、次果，提高其經(jīng)濟價值有很好的意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

澀柿牛心柿，采摘于西安市長安區(qū)大居安村，平均單果重25～35g；發(fā)酵菌株啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），保存于食品發(fā)酵實驗室；香草醛、兒茶素、無水甲醇、無水乙醇、丙酮、濃硫酸、明膠、聚乙烯二醇（PVA）、海藻酸鈉等其他試劑均為分析純，西安晶博生物科技有限公司。

S.SW-CJ-1F型凈化工作臺上海躍進醫(yī)療器械廠；Motic（BA200）光學(xué)顯微鏡廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；隔水式（GSP-9080MBE）電熱恒溫培養(yǎng)箱上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LXJ-Ⅱ離心沉淀機上海醫(yī)用分析儀器廠；高壓滅菌器上海佳騰實驗設(shè)備有限公司；UNICO2000型可見分光光度計上海尤尼柯儀器有限公司；電子恒溫電熱套北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司；PHs-3c型精密pH計上海精密科學(xué)儀器有限公司；JSM-6700F型掃描電鏡日本電子有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌懸液的制備取保藏的啤酒酵母菌種于盛有200mL無菌水的三角瓶中活化24h，并用劃線法將其接種于斜面培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)箱擴大培養(yǎng)20h后，將其接種于250mL的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)10h。將該啤酒酵母菌培養(yǎng)液在無菌條件下3000r/min離心10min，傾去上清液。用無菌生理鹽水洗滌菌體，再離心后得濕菌體。加入無菌水制成菌液濃度為2.8×109cfu/mL菌懸液備用。

1.2.2發(fā)酵用麥芽汁的制備方法將干麥芽粉碎，加4倍麥芽粉重量、溫度為60℃的水，于55～60℃的水浴鍋中保溫糖化4h，過濾，獲麥芽汁，用糖度計調(diào)節(jié)其糖度為10%，pH自然，真空抽濾，用高壓滅菌鍋在121℃滅菌20min。

1.2.3柿單寧的提取稱取1kg的青柿果，破碎后加入無水甲醇打漿，加入1.43L無水甲醇，在室溫下回流浸提14h，過濾。殘渣再用0.57L無水甲醇浸提30min，過濾，合并濾液。用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至0.54L，濃縮液加入4～5倍體積的冰醋酸，沉淀單寧。沉淀物形成后，快速過濾。將過濾得到的沉淀溶解在0.86L的甲醇中，除去不溶于甲醇的果膠物。再用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至0.43L［9］。

1.2.4柿單寧凝膠固定化啤酒酵母菌的方法在30℃下，取2.5%明膠液20mL放入燒杯中，不斷攪拌并緩慢的加入5mL 1%的PVA，再加入已活化的菌濃度為2.8×109cfu/mL的啤酒酵母菌菌懸液5mL，攪勻后，加入20mL 10%的柿單寧溶液，調(diào)整溶液pH為8.0，沉淀10min，待形成凝膠，酵母菌包埋后，分離包埋劑，用無菌蒸餾水沖洗包埋劑。將包埋劑12g（濕重）投入到麥芽汁培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，測其表觀發(fā)酵度。以上試液除柿單寧和啤酒酵母菌懸液之外，使用之前均需在115℃下滅菌15min。

1.2.5海藻酸鈉-PVA復(fù)合材料固定化啤酒酵母稱取1.25g的海藻酸鈉于無菌小燒杯中，加入無菌去離子水少許，調(diào)成糊狀，再加入剩余的水（總量一定），加熱溶解并冷卻至室溫，配制成2.5%海藻酸鈉溶液50mL。加入3g PVA，使PVA濃度達到6%，再與5mL啤酒酵母菌懸液混勻，用帶5#針頭的注射器將其以恒定速度滴到4%的CaCl2溶液中，浸泡約30min后，將凝膠珠移入500mL的三角瓶中，用無菌去離子水洗滌3次后，轉(zhuǎn)入滅菌麥芽汁進行發(fā)酵［8］。

1.2.6柿單寧凝膠固定化的啤酒酵母菌發(fā)酵效果對比調(diào)整麥芽汁培養(yǎng)基pH為5.0、初始糖度為12%、固定化包埋的啤酒酵母菌的包埋量20（包埋劑和酵母菌的體積比）、培養(yǎng)溫度為30℃，發(fā)酵36h后，測定游離酵母菌、柿單寧凝膠固定的酵母菌和常用的海藻酸鈉PVA復(fù)合材料［10］固定的酵母菌發(fā)酵的速度，研究柿單寧凝膠固定的酵母菌的發(fā)酵效果。

1.2.7柿單寧凝膠固定化的啤酒酵母菌發(fā)酵條件研究

1.2.7.1柿單寧凝膠固定化的啤酒酵母菌發(fā)酵溫度的確定分別將柿單寧凝膠固定化的啤酒酵母接入裝有50mL初始糖度為10%，自然pH的麥芽汁的三角瓶中，置于20、25、30、35、40℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h后，測定發(fā)酵液的糖度，計算真實發(fā)酵度和表觀發(fā)酵度，確定固定化酵母菌發(fā)酵溫度。

1.2.7.2pH對固定化啤酒酵母菌發(fā)酵的影響分別將柿單寧凝膠固定化的啤酒酵母菌接入50mL初始糖度為10%麥芽汁中，調(diào)整pH為3、4、5、6和7，置于30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h后，測定發(fā)酵液的糖度，計算真實發(fā)酵度和表觀發(fā)酵度，確定固定化啤酒酵母菌發(fā)酵的適宜pH。

1.2.7.3包埋量對固定化啤酒酵母菌發(fā)酵影響制備包埋量分別為10、15、20、25、30（包埋劑和酵母菌菌懸液的體積比值）的固定化啤酒酵母菌，分別將柿單寧凝膠固定化的啤酒酵母菌接入裝有50mL初始糖度為10%，自然pH麥芽汁的三角瓶中，置于30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h后，測定發(fā)酵液的糖度，計算真實發(fā)酵度和表觀發(fā)酵度，確定固定化啤酒酵母菌的最適包埋量。

1.2.7.4初始糖度對固定化啤酒酵母菌發(fā)酵的影響分別將柿單寧凝膠固定化的啤酒酵母菌接入50mL自然pH麥芽汁中，調(diào)整初始糖度為6%、8%、10%、12%、14%和16%，置于30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h后，測定發(fā)酵液的糖度，計算真實發(fā)酵度和表觀發(fā)酵度，確定固定化啤酒酵母菌發(fā)酵的最適初始糖度。

1.2.8固定化柿單寧凝膠啤酒酵母發(fā)酵條件正交實驗為了對柿單寧凝膠固定化啤酒酵母的發(fā)酵條件進行深入研究，選擇溫度、溶液pH、包埋量、初始糖度四因素進行L9（34）正交實驗，實驗方法同1.2.4，正交實驗因素水平見表1。以真實發(fā)酵度為指標，研究各因素對真實發(fā)酵度的影響，從而確定最佳的工藝條件。

表1　正交實驗因素水平表Table 1　The factors and levels of orthogonal design

1.2.9菌懸液菌數(shù)和總糖含量測定菌懸液菌數(shù)測定用血球板計數(shù)法［7］；總糖含量的測定用斐林試劑法［10］。

1.2.10真實發(fā)酵速度的測定測定發(fā)酵前發(fā)酵液總糖的含量，發(fā)酵36h后，測定發(fā)酵液中殘?zhí)堑暮?，用下面公式來計算發(fā)酵速度：

1.2.11表觀發(fā)酵速度的測定用阿貝折光儀測定發(fā)酵前后麥芽汁的糖度，并按下式計算其表觀發(fā)酵度。

表觀發(fā)酵度（%）=［（原始麥芽汁糖度-發(fā)酵后麥芽汁糖度）/原始麥芽汁糖度］×100

1.3數(shù)據(jù)處理方法

用DPS和Excel軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析和處理［11-14］。

2　結(jié)果與分析

2.1柿單寧凝膠固定化的啤酒酵母菌發(fā)酵效果研究

從圖1可知，固定的酵母菌的發(fā)酵速度明顯高于游離酵母（p＜0.05），在同樣條件下，與游離酵母菌、常用的海藻酸鈉-PVA復(fù)合材料包埋的酵母菌比較，柿單寧凝膠固定酵母菌發(fā)酵的速度最高，為96.05%，可見柿單寧包埋酵母菌具有很大的優(yōu)勢。因為活的酵母菌細胞高度密集于載體之上，并不斷生長繁殖，形成高濃度的生物催化劑，從而大大加快了反應(yīng)速度，使生產(chǎn)能力大幅度提高。固定化酵母是一種代謝異常的“工程菌”，與游離酵母細胞相比處于較高的代謝水平，在固定載體表面的固液界面上可以保持一個高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)水平，固定化改變了細胞的通透性，能使更多的營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞，使代謝加快，從而使得營養(yǎng)物質(zhì)要比游離細胞消耗的快，呈現(xiàn)出固定化發(fā)酵的速度快于游離細胞的發(fā)酵速度。

圖1　不同發(fā)酵類型下真實發(fā)酵速度的比較Fig.1　Comparation of real ferment rates under condition of different fermentation type

2.2柿單寧凝膠固定化的啤酒酵母菌發(fā)酵溫度的確定

從圖2可知，溫度對發(fā)酵影響比較明顯，在20～30℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，發(fā)酵速度加快，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時發(fā)酵速度最大，超出30℃，發(fā)酵速度減慢，但變化幅度不大。由此可知，在一定溫度范圍內(nèi)，高溫有利于提高酵母菌的繁殖活力，20℃以下發(fā)酵速度最慢，啤酒發(fā)酵的最適合溫度介于20～30℃之間，如果發(fā)酵溫度過高，則會加速酵母的自溶，自溶后產(chǎn)生大量的氨基酸，會引起高級醇的增加，最后導(dǎo)致酒變苦，且會導(dǎo)致菌種的突變和退化；如果發(fā)酵溫度過低，發(fā)酵能力降低，能發(fā)酵麥芽三糖的酵母逐漸退化為不能發(fā)酵麥芽三糖的菌［15-16］。

圖2　溫度對固定化啤酒酵母菌發(fā)酵的影響Fig.2　Effect of temperature on fermentation with immobilized Saccharomyces cerevisiae

2.3pH對固定化啤酒酵母菌發(fā)酵影響

固定的啤酒酵母菌在不同pH的麥芽汁中發(fā)酵效果見圖3。從圖3可知，麥芽汁pH對發(fā)酵影響比較明顯，隨著發(fā)酵液pH的增大，發(fā)酵速度加快，pH為5時，發(fā)酵速度最大，pH大于5，發(fā)酵速度減慢，但比較平穩(wěn)。pH影響細胞質(zhì)膜的通透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和物質(zhì)的溶解性來影響物質(zhì)的吸收［8］。在偏堿性的條件下OH-占優(yōu)勢，水合氫離子和OH-對營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度和解離狀態(tài)、細胞表面電荷平衡等方面產(chǎn)生重大影響，因而pH為7時發(fā)酵速度較慢。在酸性條件下H+可以與營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，并能從可交換的結(jié)合物或細胞表面置換出某些陽離子，從而影響細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

圖3　pH對固定化酵母菌發(fā)酵的影響Fig.3　Effect of pH on fermentation with immobilized Saccharomyces cerevisiae

2.4包埋量對固定化啤酒酵母菌發(fā)酵的影響

包埋量不同，對麥芽汁的發(fā)酵速度不同，結(jié)果見圖4。由圖4可知，包埋量越大，酵母含量越多，發(fā)酵速度越快，但驗證實驗發(fā)現(xiàn)，若包埋量過大，麥芽汁最終發(fā)酵的酒精度則隨包埋量的增加而減少，故選擇包埋量時要同時考慮發(fā)酵速度和酒精轉(zhuǎn)化率。

圖4　包埋量對固定化啤酒酵母菌發(fā)酵的影響Fig.4　Effect of embedding quantityon fermentation with immobilized Saccharomyces cerevisiae

2.5初始糖度對固定化啤酒酵母菌發(fā)酵的影響

選擇初始糖度不同的麥芽汁，固定化啤酒酵母菌發(fā)酵，結(jié)果見圖5。由圖5可知，當(dāng)初始糖度低于12%時，發(fā)酵速度隨糖量的增加而增加；但當(dāng)糖度超過12%時，由于凝膠內(nèi)底物濃度過高而抑制酵母的生長，發(fā)酵速度反而下降。因此采用初始糖度12%的麥芽汁發(fā)酵為宜。

圖5　初始糖度對固定化啤酒酵母菌發(fā)酵的影響Fig.5　Effect of initial sugar degree on fermentation with immobinzed Saccnaromyces cerevisiae

2.6固定化啤酒酵母菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

為了對柿單寧凝膠固定化的啤酒酵母的發(fā)酵條件進行深入研究，選擇溫度、溶液pH、包埋量和初始糖度4因素進行L9（34）正交實驗，實驗方法見1.2.4。以真實發(fā)酵度為考察指標，研究各因素對真實發(fā)酵度的影響，從而確定最佳的工藝條件。實驗結(jié)果見表2。

表2　正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2　The Results of the orthogonal experiment

從表2可以看出各因素對固定化真實發(fā)酵速度影響的主次順序依次為：溶液pH＞初始糖度＞包埋量＞溫度，發(fā)酵條件最優(yōu)組合為A2B1C1D3，即溫度30℃、pH4.0、包埋量為10（包埋劑和酵母菌的體積比值）、初始糖度為14%。采用最佳發(fā)酵條件進行驗證實驗，真實發(fā)酵速度可達97.2%，均高于表2中所有組合的發(fā)酵速度。故本實驗最佳發(fā)酵工藝為溫度30℃、pH4.0、包埋量為10（包埋劑和酵母菌的體積比）、初始糖度為14%。

3　結(jié)論

3.1實驗可知制備柿單寧凝膠條件溫和，增大了包埋后酵母菌的活性，為柿單寧凝膠的廣泛使用提供了可能。

3.2柿單寧凝膠固定的啤酒酵母菌與用游離酵母菌和PVA-海藻酸鈉復(fù)合材料包埋的酵母菌相比，真實發(fā)酵度高，達96.05%；在研究柿單寧凝膠固定的啤酒酵母菌的適宜發(fā)酵溫度、pH、包埋量和初始糖度的單因素實驗基礎(chǔ)上，通過正交實驗確定了包埋劑對麥芽汁的最佳發(fā)酵條件為包埋量10（包埋劑和酵母菌的體積比），麥芽汁初始糖度14%，pH為4.0，發(fā)酵溫度為30℃，此條件下進行發(fā)酵，真實發(fā)酵速度可達97.2%。

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Study on fermentation process of Saccharomyces cerevisiae immobilized by persimmon tannin gel

SUN Xiao-yuan1，2，ZHANG Bao-shan1，2，*，LIU Sha-sha1，LUO Teng1，HUANG Wen3
（1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710119，China；2.The Fruit and Vegetable Processing Technology Research Center in Shaanxi Province，Xi’an 710119，China；3.Northwest University of Politics and Law Business School，Xi’an 710119，China）

Objective：To compare the free Saccharomyces cerevisiae and immobilized Saccharomyces cerevisiae with persimmon tannin gel and immobilized Saccharomyces cerevisiae within PVA-sodium alginate and obtain a optimal set of parameters for wort fermentation with Saccharomyces cerevisiae embedded with persimmon tannin gel.Methods：Extract persimmon tannin from persimmon and mix it with crosslinking agent.Then embed Saccharomyces cerevisiae and use immobilized Saccharomyces cerevisiae with persimmon tannin gel for formentation.On the basis of single factor experiment，through the orthogonal experiment to study the effects of different parameters such as temperature，immobilized rate，pH，and initial sugar degree to the fermentation properties of immobilized Saccharomyces cerevisiae.Results：Compared with other materials the real fermentation rate of the immobilized Saccharomyces cerevisiae with persimmon tannin gel achieved 96.05%，which was the maximum value.The best fermentation conditions were as follows：immobilizing quantity 10，initial sugar degree 14%，pH4 and fermentation temperature 30℃.Under the optimal conditions，the real fermentation rate achieved 97.2%.Conclusion：The conditions of persimmon tannin gel preparation were mild，it increased the activity of embeded Saccharomyces cerevisiae and provided a possibility for the wide use of this materials.

persimmon tannin；gel；immobilized Saccharomyces cerevisiae；fermentation

TS201.1

A

1002-0306（2015）12-0142-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.021

2014－09－24

孫肖園（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品發(fā)酵與質(zhì)量控制。

張寶善（1968-），男，博士，教授，主要從事食品微生物及食品發(fā)酵方面的研究。

陜西師范大學(xué)中央高?？蒲邪l(fā)展專項項目資助（GK201405006）；西安市科技計劃項目（SF1234-2）。