孫協(xié)軍，李佳偉，李秀霞，畢海燕，薛曉霞

（渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013）

響應(yīng)面法優(yōu)化鹽藻β-胡蘿卜素超聲波提取工藝

孫協(xié)軍，李佳偉，李秀霞*，畢海燕，薛曉霞

（渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013）

對鹽藻β-胡蘿卜素超聲波輔助提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果表明，在所選擇的幾種溶劑中，無水乙醇的提取效果最好，以β-胡蘿卜素得率為衡量指標(biāo)，各溶劑提取效率的順序?yàn)椋簾o水乙醇＞95%乙醇＞無水乙醇和乙酸乙酯混合溶液（2∶1，v/v）＞石油醚＞三氯甲烷＞乙腈＞乙酸乙酯。通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對超聲波提取鹽藻β-胡蘿卜素的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到了相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，各因素相互間均沒有交互作用，三個(gè)考查因素對鹽藻中β-胡蘿卜素得率影響的順序?yàn)椋撼暡üβ剩境晻r(shí)間＞液固比，確定超聲波輔助提取β-胡蘿卜素的最佳工藝參數(shù)為：液固比500mL/g、超聲波功率496W、超聲時(shí)間7min，β-胡蘿卜素得率的預(yù)測值為1.282%，在優(yōu)化條件下，β-胡蘿卜素得率測定值為1.273%，說明提取模型的適應(yīng)性良好。

鹽藻，β-胡蘿卜素，超聲波提取，工藝

鹽藻，即鹽生杜氏藻（Dunaliella Salina），屬綠藻門，綠藻綱，團(tuán)藻目，鹽藻科［1］，為綠色單細(xì)胞微藻，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最耐鹽的真核生物之一，可在接近淡水直至飽和鹽水的環(huán)境中生存和繁殖［2］，鹽藻可以在鹽堿地、鹽湖、粘土地、灘涂以及淺海、湖泊養(yǎng)殖［3］。在我國的內(nèi)蒙吉蘭泰和海南等地，都已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了鹽藻的養(yǎng)殖和加工的工業(yè)化生產(chǎn)。鹽藻細(xì)胞內(nèi)有一杯狀色素體，色素體內(nèi)的色素主要是葉綠素和β-胡蘿卜素，鹽藻在高鹽壓力和營養(yǎng)限制的條件下，β-胡蘿卜素積累量迅速增加，鹽藻中累積的β-胡蘿卜素含量最高可達(dá)藻體干重的14%［4］。人們主要采用植物油或有機(jī)溶劑作為萃取劑來提取鹽藻中的β-胡蘿卜素，鹽藻中β-胡蘿卜素主要以游離形式存在，但基本不含類胡蘿卜素酯，所以，鹽藻β-胡蘿卜素萃取液可不經(jīng)皂化處理。溶劑直接萃取鹽藻β-胡蘿卜素的效率較高，但耗時(shí)較長，為提高溶劑萃取的效率，需要外加新技術(shù)的輔助，而超臨界二氧化碳萃?。?］、超聲波［6-7］及微波［8］等輔助提取是近年來常用的類胡蘿卜素提取新技術(shù)。其中，超聲波輔助提取具有耗時(shí)短和效率高的特點(diǎn)。采用超聲波輔助溶劑萃取進(jìn)行β-胡蘿卜素的提取，借助于超聲波的機(jī)械效應(yīng)和空化作用，物料組織細(xì)胞被破壞，細(xì)胞內(nèi)容物溶出，提高了溶劑的萃取效率。近年來，超聲波輔助萃取技術(shù)在植物原料β-胡蘿卜素的提取上得到廣泛應(yīng)用［9］，已經(jīng)具有一定的應(yīng)用基礎(chǔ)，而鹽藻中存在著β-胡蘿卜素的多種順式異構(gòu)體及其他類胡蘿卜素物質(zhì)，采用分光光度法進(jìn)行定量存在一定的誤差。本實(shí)驗(yàn)以工業(yè)鹽藻粉為原料，采用HPLC-DAD方法分離定量，對鹽藻粉β-胡蘿卜素的超聲波輔助提取工藝進(jìn)行研究，為微藻粉類胡蘿卜素提取方面的應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鹽藻粉購自大連豐源達(dá)餌料有限公司；β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、丙酮色譜級，天津大茂化學(xué)試劑廠；其他試劑均為分析純。

P680型高效液相色譜儀（配DAD檢測器） 美國戴安公司；FA2004型電子天平上海恒平科學(xué)儀器有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；SCIENTZ-（Ⅱ）D型超聲波細(xì)胞粉碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司；PS02-AD-DI型超純水機(jī)上海訊輝環(huán)保科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵上海申光儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1不同提取溶劑的影響準(zhǔn)確稱取鹽藻粉0.4000g，置于100mL玻璃燒杯中，向燒杯中分別加入乙酸乙酯、無水乙醇、95%乙醇、無水乙醇/乙酸乙酯混合液（2∶1，v/v）、乙腈、三氯甲烷和石油醚100mL，設(shè)定超聲波破碎儀功率為300W，探頭置于液面下1.5cm處，超聲2s/間歇2s，超聲90次，即總超聲時(shí)間3min，總間歇時(shí)間3min，提取后的混合液減壓抽濾，等體積的提取溶劑洗滌抽濾瓶中濾渣。所得濾液在50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉大部分溶劑后，乙酸乙酯溶解并定容至50mL，0.45μm膜過濾后，HPLC檢測其β-胡蘿卜素濃度。

1.2.2液相色譜檢測條件Develosil C30色譜柱；甲醇：丙酮（30/70，v/v）為流動(dòng)相；流速1.0mL/min；柱溫25℃；檢測波長：452nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品4.8mg，丙酮溶解并定容至25mL，配制成β-胡蘿卜素濃度為192μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再分別稀釋至β-胡蘿卜素濃度為192、153.6、115.2、76.8、38.4和19.2μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。此系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.2條件進(jìn)行檢測，以峰面積（mAU）為橫坐標(biāo)，β-胡蘿卜素濃度平均值（μg/mL）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4β-胡蘿卜素得率的計(jì)算方法β-胡蘿卜素得率（%）=提取液中β-胡蘿卜素濃度×定容體積/鹽藻粉質(zhì)量×100

1.2.5提取單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)液固比的影響：分別稱取1.0000、0.5000、0.3333、0.2500、0.2000和0.1667g鹽藻粉置于100mL燒杯中，向5個(gè)燒杯中各加入100mL無水乙醇，使其液固比分別為100、200、300、400、500和600mL/g，固定超聲波破碎儀功率為300W，總超聲時(shí)間3min（總間歇時(shí)間3min，每工作2s間歇2s），進(jìn)行浸提實(shí)驗(yàn)，后繼步驟同1.2.1，比較β-胡蘿卜素得率。

超聲波功率的影響：稱取鹽藻粉0.2500g 5份，分別置于100mL燒杯中，向5個(gè)燒杯中各加入100mL無水乙醇，使其液固比為400mL/g，選取超聲波功率分別為200、300、400、500和600W，總超聲時(shí)間3min（總間歇時(shí)間3min，每工作2s間歇2s），進(jìn)行浸提實(shí)驗(yàn)，后繼步驟同1.2.1，比較β-胡蘿卜素得率。

超聲時(shí)間的影響：稱取鹽藻粉0.4000g 5份，分別置于100mL燒杯中，向5個(gè)燒杯中各加入100mL無水乙醇，使其液固比為250mL/g，選取超聲波功率為300W，分別提取1、2、4、6、8和10min（超聲2s/間歇2s），后繼步驟同1.2.1，比較β-胡蘿卜素得率。

1.2.6響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為進(jìn)一步確定超聲波輔助提取條件和各因素的影響順序，依據(jù)design-expert 7.0進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以β-胡蘿卜素得率為考察指標(biāo)，以液固比（X1）、超聲波功率（X2）和超聲時(shí)間（X3）為自變量，共設(shè)立20個(gè)處理組，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1　鹽藻β-胡蘿卜素超聲波提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1　Response surface experiment design of ultrahigh pressure extraction of β-carotene from Dunaliella salina

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，以全反式β-胡蘿卜素得率為考察指標(biāo)。

2　結(jié)果與分析

2.1HPLC分離結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液及鹽藻提取液的液相色譜圖如圖1和圖2所示。參考前人的研究成果［4］，采用保留時(shí)間和DAD光譜掃描圖（見圖1和圖2）方法對圖2提取液中全反式β-胡蘿卜素定性，確認(rèn)保留時(shí)間15.142min色譜峰為全反式β-胡蘿卜素，其最大吸收波長為451.9nm，與圖1中反式β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的最大吸收波長（見圖1，452.4nm）相近，而保留時(shí)間12.975的色譜峰則為α-胡蘿卜素或β-胡蘿卜素的其他類似物［10］。在圖2中，保留時(shí)間為12.975的色譜峰前出峰的物質(zhì)含量均較低，沒有得到質(zhì)量較好的光譜掃描圖，無法確認(rèn)其來源。從圖2可以看出，鹽藻提取液中的反式β-胡蘿卜素色譜峰與其他色譜峰分離度較高。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.3815X-0.7905，R2=0.9991，其中Y為濃度（μg/mL），X為峰面積（mAU），回歸方程的線性范圍為19.2～192μg/mL，按3倍信噪比（N/S）計(jì)算，反式β-胡蘿卜素（以下簡稱β-胡蘿卜素）最低檢出限為0.5μg/mL。

圖1　β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1　Chromatogram of β-carotene standard

圖2　鹽藻β-胡蘿卜素提取液色譜圖Fig.2　Chromatogram of β-carotene carotene from D.salina

2.2鹽藻β-胡蘿卜素提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1不同提取溶劑對鹽藻β-胡蘿卜素得率的影響選擇適合的溶劑是提高提取效率的重要條件，在常用的溶劑中，對β-胡蘿卜素溶解度的高低順序?yàn)椋核臍溥秽疽颐眩菊和椋疽宜嵋阴ィ颈疽掖迹疽译妫炯状迹?0-11］，在本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)鹽藻粉的物料性質(zhì)和β-胡蘿卜素在不同溶劑中的溶解度差異選擇了以乙醇和乙酸乙酯為代表的幾種溶劑進(jìn)行了提取實(shí)驗(yàn)，不同溶劑作為提取劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。各溶劑提取β-胡蘿卜素得率高低順序?yàn)椋簾o水乙醇＞95%乙醇＞乙醇/乙酸乙酯（2∶1，v/v）混合溶液＞石油醚＞三氯甲烷＞乙腈＞乙酸乙酯，無水乙醇的提取效率明顯高于其他溶劑（p＜0.05），這與常規(guī)提取方法中提取β-胡蘿卜素的最佳提取溶劑不同［12］，但與本實(shí)驗(yàn)室中以超高壓技術(shù)提取鹽藻β-胡蘿卜素的溶劑選擇結(jié)果一致。與四氫呋喃和乙醚等溶劑相比，無水乙醇的極性相對較高，鹽藻粉在極性較高的溶劑中的分散性很好，卻很難浸潤在石油醚等溶劑中，通常是成團(tuán)散布在溶劑表面。與含水的乙醇溶液及甲醇等極性更高的溶液相比，β-胡蘿卜素在無水乙醇中的溶解性更好。因此選擇無水乙醇為鹽藻β-胡蘿卜素的提取溶劑，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

2.2.2液固比的影響在以無水乙醇為提取溶劑，超聲波功率為300W，超聲時(shí)間3min的條件下，液固比對鹽藻β-胡蘿卜素得率的影響結(jié)果見圖4。由圖4可見，在液固比從100mL/g增加到400mL/g時(shí)，β-胡蘿卜素得率從0.323%增加到0.823%，提高幅度較大。當(dāng)液固比高于400mL/g時(shí)，隨著液固比的增加，β-胡蘿卜素得率逐漸下降；在液固比為600mL/g時(shí)，鹽藻β-胡蘿卜素得率降為0.746%。本實(shí)驗(yàn)所用超聲波破碎儀要求料液高度在3cm以上，需要較多的提取溶劑，因此，本實(shí)驗(yàn)在液固比水平的設(shè)置上，同采用超聲波清洗器所做實(shí)驗(yàn)有較大差異［6］。而且，由于本實(shí)驗(yàn)用鹽藻粉β-胡蘿卜素含量較高（1%左右），而β-胡蘿卜素在乙醇等溶劑中溶解度較低，在1.00～4.00g/100g溶劑左右［10］，較高的液固比有助于提高β-胡蘿卜素的溶出，提高其提取效率，也有利于減壓抽濾操作的進(jìn)行。但較高的液固比增加了后繼旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)步驟的操作時(shí)間，導(dǎo)致β-胡蘿卜素提取液在旋蒸水浴中停留時(shí)間增長，引起β-胡蘿卜素一定量的損失，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，選擇400mL/g的液固比進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)較為合適。

圖3　不同溶劑對鹽藻β-胡蘿卜素得率的影響Fig.3　Effect of different solvent on β-carotene yield of D.Salina

圖4　液固比對鹽藻β-胡蘿卜素得率的影響Fig.4　Effect of liquid to solid ratio on β-carotene yield of D.Salina

2.2.3超聲波功率的影響超聲波功率在達(dá)到200W后對類胡蘿卜素的提取產(chǎn)生有效的強(qiáng)化作用［13-14］。因此，本實(shí)驗(yàn)將超聲波功率設(shè)定在200～600W之間。超聲波功率對鹽藻β-胡蘿卜素得率的影響結(jié)果見圖5，從圖5中可以看出，在超聲波功率由200W增加到400W時(shí)，β-胡蘿卜素得率由0.444%提高到0.956%。這是由于在超聲波的空化作用下，鹽藻細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，β-胡蘿卜素溶出，而超聲波功率的提高則有助于有效成分的溶出更加迅速完全，提高了β-胡蘿卜素的得率［13］。當(dāng)超聲波功率超過400W后，β-胡蘿卜素的得率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，在超聲波功率升高為600W時(shí)，β-胡蘿卜素的得率降為0.879%；此時(shí)，超聲波所引起的機(jī)械摩擦作用已經(jīng)引起提取溶劑溫度明顯的上升，β-胡蘿卜素是對熱敏感的一類色素，而超聲波功率越高，機(jī)械作用越明顯，因此，選擇400W為適合的超聲波功率進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖5　超聲波功率對鹽藻β-胡蘿卜素得率的影響Fig.5　Effect of ultrasound power on β-carotene yield of D.Salina

2.2.4超聲時(shí)間的影響超聲時(shí)間對鹽藻β-胡蘿卜素得率的影響結(jié)果見圖6所示，由圖6可知，超聲時(shí)間對鹽藻β-胡蘿卜素得率的影響規(guī)律與常規(guī)提取方法類似［12］。在液固比為400mL/g和超聲波功率為400W的條件下，隨著超聲波破碎儀工作時(shí)間的增加，β-胡蘿卜素在6min內(nèi)的得率逐漸增加，在6min時(shí)達(dá)到1.157%；在6min以后，隨著超聲時(shí)間增加，β-胡蘿卜素得率逐漸下降，在10min時(shí)降為0.856%。由于鹽藻細(xì)胞通常為十幾微米左右，提取溶劑在較短時(shí)間內(nèi)即可以滲透到細(xì)胞內(nèi)部，使得β-胡蘿卜素的溶解擴(kuò)散迅速達(dá)到平衡，因此β-胡蘿卜素的最佳提取時(shí)間較短。而在提取達(dá)到溶解擴(kuò)散平衡以后，較長的超聲時(shí)間對β-胡蘿卜素穩(wěn)定性影響的效果加大，因此，選擇超聲時(shí)間為6min進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖6　超聲時(shí)間對鹽藻β-胡蘿卜素得率的影響Fig.6　Effect of extracting time on β-carotene yield of D.Salina

2.3鹽藻β-胡蘿卜素提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

通過單因素實(shí)驗(yàn)，選取液固比（X1）、超聲波功率（X2）和超聲時(shí)間（X3）進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素、水平和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。用Design-expert 7.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到鹽藻中β-胡蘿卜素得率的回歸方程如下：

Y=1.245-0.021X1+0.065X2+0.057X3+0.012X1X2+ 0.011X1X3-0.009X2X3-0.042X12-0.033X22-0.002X32

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2　Experimental results and analysis of the response surface

表3 方差分析結(jié)果Table 3　Analysis of variance results

方差分析結(jié)果見表3，由表3可以看出，模型極顯著（p＜0.01），而失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），模型的相關(guān)系數(shù)R2為89%，說明模型擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，該模型是合適的，可以用該模型方程來分析和預(yù)測不同超聲波輔助提取條件下鹽藻β-胡蘿卜素得率的變化。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，各因素相互間交互作用影響均不顯著（p＞0.05），三個(gè)考察因素對鹽藻中β-胡蘿卜素得率影響的順序?yàn)椋撼暡üβ剩境晻r(shí)間＞液固比。

通過design expert7.0軟件擬合，得出超聲波輔助提取β-胡蘿卜素的最佳工藝參數(shù)為：液固比500mL/g，超聲波功率496W，超聲時(shí)間7min，β-胡蘿卜素得率預(yù)測值為1.282%。在此優(yōu)化條件下，采用超聲波輔助提取鹽藻β-胡蘿卜素，提取實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，β-胡蘿卜素得率實(shí)測值為1.273%，與預(yù)測值的相對誤差為0.7%，與預(yù)測結(jié)果基本相符。

3　結(jié)論

3.1在本研究選取的六種溶劑中，無水乙醇提取效果最好。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，各因素相互間交互作用影響不顯著，三個(gè)考察因素對鹽藻中β-胡蘿卜素得率影響的順序?yàn)椋撼暡üβ剩境晻r(shí)間＞液固比。

3.2建立了超聲波輔助提取鹽藻β-胡蘿卜素的數(shù)學(xué)模型，確定超聲波輔助提取β-胡蘿卜素的最佳工藝參數(shù)為：液固比500mL/g，超聲波功率496W，超聲時(shí)間7min，在優(yōu)化條件下，鹽藻β-胡蘿卜素得率為1.273%。

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Optimization of extracting technique assisted by ultrasound assisted extraction of β-carotene from Dunaliella salina by response surface methodology

SUN Xie-jun，LI Jia-wei，LI Xiu-xia*，BI Hai-yan，XUE Xiao-xia
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Engineering and Technology Research Center of Food Preservation，Processing and Safety Control of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

Extracting technique assisted by ultrasound assisted extraction method of β-carotene from D.Salina was optimized.The result showed that absolute ethanol was the optimal solvent among these kinds of solvent selected，the β-carotene yield of D.Salina was used as measurement index，the sequence of extraction efficiency of different solvent was that absolute ethanol＞95%ethanol＞absolute ethanol/acetic ether（2∶1，v/v）＞petroleum＞chloroform＞acetonitrile＞acetic ether.The mathematical model of ultrasound assisted D.Salina β-carotene extraction was established by response surface methodology，within the scope of each factor levels，there was no interaction between different factors.The sequence of the effect of three factors on β-carotene yield was that ultrasonic power＞ultrasonic time＞ratio of liquid to solid.The optimal condition for extraction technique was that L/S 500mL/g，ultrasonic power 496W，ultrasonic time 7min，under the optimal condition，the predicted β-carotene yield was 1.282%，and the measured value was 1.273%，it was described that the adaptable of model was good. Key words：D.Salina.；β-carotene；ultrasound assisted extraction；technology

TS201.1

B

1002-0306（2015）12-0278-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.049

2014－07－21

孫協(xié)軍（1969-），男，大學(xué)本科，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：食品資源開發(fā)利用。

李秀霞（1973-），女，博士，副教授，研究方向：水產(chǎn)品貯藏加工。

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD29B06）；遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（LNSAKF2011015）。