紀(jì)懿芳，胡文忠，姜愛麗，馮　可（.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連604；.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連6600；.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連604）

LAMP技術(shù)快速檢測(cè)海產(chǎn)品副溶血弧菌的條件優(yōu)化

紀(jì)懿芳1，胡文忠2，*，姜愛麗2，馮可3
（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600；3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024）

本研究以副溶血弧菌不耐熱溶血素tlh為目標(biāo)基因設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，并對(duì)特異性、靈敏度進(jìn)行了驗(yàn)證。LAMP最佳反應(yīng)條件為，外內(nèi)引物濃度比為1∶8，Mg2+反應(yīng)濃度為4 mmol/L，dNTPs濃度為3.5 mmol/L，溫度為65℃，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為1 h，只對(duì)副溶血弧菌產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)，與其余細(xì)菌不產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)，細(xì)菌基因組DNA和純培養(yǎng)物的靈敏度約為5.45×101fg/μL和140 cfu/mL，對(duì)人工污染食品樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為2.8×102cfu/mL。該方法反應(yīng)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高。

副溶血弧菌，LAMP，海產(chǎn)品，tlh

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP），是一種主要的食源性致病菌，嗜鹽的革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛分布于沿海、河口環(huán)境和魚、蝦、貝等海產(chǎn)品中［1-2］。在我國(guó)，副溶血弧菌引起的食物中毒在所有細(xì)菌性腸胃炎中占有較高的比重，對(duì)人們生命安全危害極大。在報(bào)道的食物中毒病例中，由副溶血弧菌引起的病例高達(dá)31.1%。副溶血弧菌引起的食物中毒臨床上的主要發(fā)病癥狀為腹痛、嘔吐、腹瀉以及水樣腹瀉為主。每年的6～10月是副溶血弧菌食物引發(fā)中毒的高發(fā)期，海產(chǎn)品、咸菜、熟肉類等腌制品是其感染的主要對(duì)象［3-4］。傳統(tǒng)的副溶血弧菌的檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，靈敏度低。因此，研發(fā)精確先進(jìn)的生物化學(xué)方法，以快速地檢測(cè)副溶血性弧菌，對(duì)提高食品的安全性，確保人們的生命安全，減少損失顯得尤為重要。目前，副溶血弧菌的分子生物學(xué)快速檢測(cè)方法主要有普通PCR［5］、多重PCR［6］、熒光定量PCR［7］、脈沖場(chǎng)電泳［8］、基因芯片［9］等。但是這些方法操作繁瑣需要復(fù)雜精密的儀器，不適合基層實(shí)驗(yàn)室。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等［10］在2000年研發(fā)的一種新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法，LAMP技術(shù)是在恒定的溫度下，針對(duì)靶基因上的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP在恒定溫度下，不到1 h就能達(dá)到109～1010倍的擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)［11］。LAMP技術(shù)自2000年開發(fā)以來因其簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒病原體、真菌病原體檢測(cè)等方面［12］。副溶血弧菌產(chǎn)生的各種毒力因子是導(dǎo)致致病過程產(chǎn)生的主要原因，溶血性毒素［13］、粘附因子［14］、侵襲力［15］、尿素酶［16］、外膜蛋白［17］等是至今為止發(fā)現(xiàn)的副溶血弧菌的主要毒力因子［18］，針對(duì)溶血素設(shè)計(jì)的引物和探針不能同時(shí)檢測(cè)所有的致病菌株。不耐熱溶血毒素（tlh）是被Taniguchi H等［19］發(fā)現(xiàn)的主要存在于副溶血弧菌的胞外分泌，是一種具有非典型的磷脂酶，只有在卵磷脂存在的條件下才具有溶血活性，人和馬的紅細(xì)胞都能夠被其溶解，在副溶血弧菌中的功能和致病性至今尚沒有明確的理論依據(jù)，具有良好的種屬特異性，可被用來當(dāng)作副溶血弧菌的快速檢測(cè)方法精確的檢測(cè)依據(jù)。李志峰等［20］對(duì)副溶血弧菌的tlh基因進(jìn)行基因序列分析和分子克隆，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)tlh可以作為特異性基因，在分子生物學(xué)檢測(cè)中可作為靶基因?qū)ζ湓O(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)在副溶血弧菌分子檢測(cè)和微生物監(jiān)控等應(yīng)用方面具有很好的價(jià)值，因此本研究以tlh為目標(biāo)基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，并優(yōu)化條件，為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)海產(chǎn)品提供可行性方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

主要培養(yǎng)基3.5%氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，3%氯化鈉堿性蛋白胨水，TCBS瓊脂（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Vibrio Parahemolyticus，CICC 21617）中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；VP1、VP2為實(shí)驗(yàn)室從海產(chǎn)品中提取鑒定傳代保存的副溶血弧菌菌株，用于LAMP方法的特異性實(shí)驗(yàn)；霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Vibrio cholera，CICC23794）、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Staphyloccocus aureus，ATCC6538）、鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Salmo-nella typhimurium enes，ATCC19111）、單核細(xì)胞增多性李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（L.monocytogenes，ATCC19111）、腸出血性大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Enteroh-emorrhage E.coli，CICC21530）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Enterotoxi-genic Escherichia coli，CICC10414）、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimuriu-m，CMCC（B）50071）、蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株［Bacillus cereus，CMCC（B63301）］、腸侵襲性大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（EIEC，CICC10661）、創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株（Vibrio vulnificus，ATCC27562）、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Staphylococcus，CMCC26069）、痢疾志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Shigella，CMCC51105）、普通變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Proteusvulgaris，CMCC49027）、產(chǎn)氣腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Enterobacteraerogenes，ATCC13048）由大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院食品安全實(shí)驗(yàn)室提供；Bst DNA聚合酶、Thermopol反應(yīng)緩沖液套裝NEB公司；betaineSigma Aldrich公司；dNTP Mixture、MgSO4、100 bp DNA ladder Maker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒大連寶生物工程有限公司。

DYY-11型電泳儀電源北京市六一儀器廠；DYCP-31F型電泳儀北京市六一儀器廠；TC-512型PCR儀Techne公司；BioSpectrum 310凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)UVP公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種活化在無菌的條件下將副溶血弧菌的凍干菌粉用液體培養(yǎng)基溶解，溶解后的菌懸液移至氯化鈉堿性蛋白胨水液體培養(yǎng)基試管中混勻，30℃培養(yǎng)18～24 h，轉(zhuǎn)接2～3次。

1.2.2DNA模板的制備取1 mL過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌菌懸液，12000 r/min離心3 min，棄上清，重復(fù)2次，沉淀按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明，提取細(xì)菌基因組DNA。

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找副溶血弧菌的高度保守序列不耐熱溶血素tlh，根據(jù)引物在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)Primer Explorer 4.0，設(shè)計(jì)一套LAMP引物，包括兩條內(nèi)引物和兩條外引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物序列見表1。

表1　副溶血性弧菌LAMP引物Table 1　The primer sequences of LAMP

1.2.4LAMP反應(yīng)體系及條件優(yōu)化

1.2.4.1LAMP擴(kuò)增體系25 μL LAMP反應(yīng)體系：10×反應(yīng)緩沖液（New England Biolabs）2.5 μL，dNTPs Mixture（TaKaRa）1.4 mmol/L，外引物F3/B3各0.2 μmol/L，內(nèi)引物FIP/BIP各1.6 μmol/L，MgSO4（New England Biolabs）1.5 μL，甜菜堿（Sigma）1 mol/L，Bst DNA聚合酶大片段（New England Biolabs）8 U，細(xì)菌DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL，配制好混勻離心，于65℃溫育60 min，80℃滅活10 min，產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，同時(shí)肉眼觀察反應(yīng)體系的濁度和顏色變化。

1.2.4.2反應(yīng)條件的優(yōu)化選擇對(duì)LAMP反應(yīng)影響較為重要的條件：內(nèi)外引物濃度比，不同濃度梯度的Mg2+，dNTPs，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，當(dāng)所考察的條件變化時(shí)，其余條件按照（1.2.4.1）的體系操作，電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，確立最佳反應(yīng)條件。

a.內(nèi)外引物濃度比值的確定取內(nèi)外引物分別加ddH2O稀釋到10 μmol/L和50 μmol/L，設(shè)定外引物的濃度始終為0.2 mmol/L，外內(nèi)引物濃度比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8，確定最佳反應(yīng)濃度比。

b.Mg2+濃度的確定Mg2+濃度影響酶的活性，實(shí)驗(yàn)選取0、2、4、6、8、10、12 mmol/L的Mg2+進(jìn)行LAMP實(shí)驗(yàn)，確定最佳Mg2+濃度。

c.dNTPs濃度的確定加入dNTPs至反應(yīng)體系中，調(diào)節(jié)dNTPs的濃度為0、1.5、2.5、3.5、4.5 mmol/L進(jìn)行LAMP實(shí)驗(yàn)，確定最佳dNTPs反應(yīng)濃度。

d.反應(yīng)溫度的確定Bst酶的最適反應(yīng)溫度為65℃，取反應(yīng)溫度為61、63、65、67、69℃，確定最佳反應(yīng)溫度。

e.反應(yīng)時(shí)間的確定選取反應(yīng)時(shí)間為20、30、40、50、60、70、80 min，電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，確立最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5特異性實(shí)驗(yàn)應(yīng)用LAMP方法同時(shí)檢測(cè)4株副溶血弧菌和大腸桿菌等14株非副溶血弧菌。

1.2.6靈敏度實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1基因組DNA靈敏度檢測(cè)用試劑盒提取副溶血弧菌基因組DNA，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值計(jì)算DNA濃度，10倍比例稀釋DNA原液到10-1～10-9，各濃度梯度進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。DNA鏈上的堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)在260 nm處具有較強(qiáng)的吸收峰。

1.2.6.2細(xì)菌純培養(yǎng)物靈敏度檢測(cè)取振蕩過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌菌懸液，用生理鹽水進(jìn)行10倍比例系列稀釋至10-1～10-8，應(yīng)用稀釋平板法計(jì)算菌液濃度，同時(shí)各濃度梯度取1 mL提取細(xì)菌基因組DNA。

1.2.7人工污染副溶血弧菌食品檢測(cè)取經(jīng)國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)不含副溶血弧菌的牡蠣樣品25 g加入到225 mL的氯化鈉堿性蛋白胨水中，用拍擊式均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min，制備成均質(zhì)液。取8 mL均質(zhì)液加入已知濃度（1.2.6.2）的每個(gè)稀釋梯度的副溶血弧菌2 mL，各取1 mL用試劑盒法提取DNA。

2　結(jié)果與討論

2.1LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1內(nèi)外引物濃度比內(nèi)外引物不同比來確定最佳的引物添加量，LAMP反應(yīng)的內(nèi)外引物濃度過低會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不完全而使產(chǎn)物少，過高又會(huì)反應(yīng)不充分，一般情況下取外內(nèi)引物濃度比為1∶4～1∶8，實(shí)驗(yàn)保持外引物的濃度為0.2 μmol/L，通過改變內(nèi)引物的濃度來改變二者的比例。如圖1所示，當(dāng)外引物和內(nèi)引物濃度比為1∶6時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增，當(dāng)濃度比為1∶8時(shí)擴(kuò)增效果最佳，確立最佳的外內(nèi)引物濃度為，外引物各0.2 μmol/L，內(nèi)引物各1.6 μmol/L。

圖1　內(nèi)外引物濃度比對(duì)LAMP擴(kuò)增的影響Fig.1　Effect of ratio of the concentration of the inner primers and outer primer on the LAMP reaction

2.1.2最適Mg2+濃度Mg2+的濃度影響反應(yīng)產(chǎn)物的多少，對(duì)反應(yīng)的特異性也有顯著的影響，Mg2+是Bst DNA聚合酶的活性因子，濃度過低會(huì)影響聚合酶的活性，過高則會(huì)影響反應(yīng)的特異性。如圖2所示，當(dāng)Mg2+濃度過低時(shí)沒有出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，而當(dāng)Mg2+反應(yīng)濃度為4 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶最明亮，效果最佳。

圖2　Mg2+濃度對(duì)LAMP擴(kuò)增的影響Fig.2　Effect of Mg2+concentrations on the LAMP reaction

2.1.3最適dNTPs濃度dNTPs的濃度選擇5個(gè)濃度梯度，如圖3所示，當(dāng)dNTPs濃度為0時(shí)沒有發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，當(dāng)dNTPs濃度為3.5 mmol/L擴(kuò)增條帶最亮，效果最佳。

圖3dNTPs濃度對(duì)LAMP擴(kuò)增的影響Fig.3　Effect of dNTPs concentrations on the LAMP reaction

2.1.4反應(yīng)溫度如圖4所示，在5種溫度條件下都發(fā)生了擴(kuò)增，但是擴(kuò)增的產(chǎn)物量有所不同，當(dāng)反應(yīng)溫度為65℃時(shí)反應(yīng)條帶最亮，所以選擇65℃為最適反應(yīng)溫度。

2.1.5反應(yīng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)選取反應(yīng)時(shí)間20～80 min，如圖5所示，在20 min時(shí)候沒有出現(xiàn)擴(kuò)增，在30 min出現(xiàn)少量擴(kuò)增，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)擴(kuò)增較為明顯，為達(dá)到充分反應(yīng)，選取60 min為反應(yīng)完成時(shí)間。

圖4　反應(yīng)溫度對(duì)LAMP擴(kuò)增的影響Fig.4　Effect of temperature on the LAMP reaction

圖5　反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP擴(kuò)增的影響Fig.5　Effect of time concentration on the LAMP reaction

2.2特異性實(shí)驗(yàn)

如圖6所示，只有4株副溶血弧菌（泳道1、2、3、14）擴(kuò)增出梯形條帶，其他14株非副溶血弧菌（泳道2～ 11、15～20）均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，可見該方法具有較好的特異性。

圖6LAMP特異性實(shí)驗(yàn)Fig.6　Specificity of LAMP assay

2.3靈敏度實(shí)驗(yàn)

2.3.1基因組DNA靈敏度副溶血弧菌基因組DNA濃度為5.45×106fg/μL，10倍比例稀釋進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，如圖7所示，當(dāng)基因組DNA濃度為5.45×101fg/μL時(shí)，LAMP反應(yīng)仍可以看出擴(kuò)增條帶，所以LAMP檢測(cè)副溶血弧菌基因組DNA檢測(cè)限約為5.45×101fg/μL。

圖7LAMP檢測(cè)基因組DNA的靈敏度Fig.7　Detection limit of LAMP for genomic DNA

2.3.2副溶血弧菌純培養(yǎng)物靈敏度如圖8所示，原菌液濃度為1.4×108cfu/mL，將菌液10倍比例稀釋各濃度梯度進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)菌液濃度為1.4×102～1.4×107cfu/mL時(shí)均出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，當(dāng)濃度為1.4×101cfu/mL時(shí)反應(yīng)未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，電泳觀察結(jié)果檢測(cè)副溶血弧菌純培養(yǎng)物靈敏度為140 cfu/mL。

圖8LAMP檢測(cè)純培養(yǎng)物靈敏度Fig.8　Detection limit of LAMP for pure cultures

2.3.3人工污染副溶血弧菌食品檢測(cè)靈敏度如圖9所示，人工污染副溶血弧菌的牡蠣樣品中的菌液濃度為2.8～2.8×107cfu/mL，當(dāng)菌液濃度為28 cfu/mL時(shí)，電泳反應(yīng)未出現(xiàn)梯狀條帶，當(dāng)菌液的濃度為2.8× 102cfu/mL時(shí)，可以看見擴(kuò)增條帶，因此，人工污染副溶血弧菌的牡蠣樣品的最低檢出限為2.8×102cfu/mL。

圖9　人工污染食品樣品LAMP檢測(cè)結(jié)果Fig.9　The LAMP result of contaminated food samples

3　結(jié)論與討論

近年來，全球所有被確診的腹瀉性腸胃炎病例中，有50%～70%的感染者是由于食用未煮熟的海產(chǎn)品而引發(fā)的副溶血弧菌食物中毒［1］。副溶血弧菌的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法要經(jīng)過基礎(chǔ)的分離、增菌、鏡檢和生化鑒定等繁瑣步驟，現(xiàn)代進(jìn)出口食品中副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法常有實(shí)時(shí)熒光PCR、LAMP和MPCR-DHPLC法等，并結(jié)合傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒定。此外目前還有吖啶、橙染色法、高通量微生物鑒定儀、蛋白芯片法和電化學(xué)免疫傳感器等實(shí)驗(yàn)室中使用的檢測(cè)技術(shù)?，F(xiàn)代分子生物技術(shù)因快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)已經(jīng)逐步進(jìn)入市場(chǎng)并占有主流地位。

LAMP技術(shù)作為分子生物學(xué)方法之一，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、成本低等特點(diǎn)，并具有廣泛的應(yīng)用前景。但LAMP技術(shù)發(fā)展至今仍然存在著一些不足之處，主要有LAMP反應(yīng)靈敏度極高，反應(yīng)又是在恒溫的條件下進(jìn)行的，反應(yīng)產(chǎn)生的氣溶膠很容易污染接續(xù)實(shí)驗(yàn)，容易造成假陽性；技術(shù)原理和引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜也限制了該技術(shù)發(fā)展；不能有效區(qū)分活死細(xì)菌也不能進(jìn)行定量檢測(cè)；通量較小，每次只能檢測(cè)一種致病菌；對(duì)產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增不能有效的區(qū)分，只能判斷產(chǎn)物是否發(fā)生擴(kuò)增，必須做相應(yīng)的空白實(shí)驗(yàn)。但是，LAMP技術(shù)在靈敏度和特異性以及反應(yīng)時(shí)間都遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于PCR反應(yīng)，LAMP技術(shù)以后將沿著研制多重LAMP試劑盒、新型指示劑以及與其他技術(shù)相結(jié)合的方向發(fā)展，如LAMP和芯片結(jié)合，LAMP和橫向流動(dòng)試紙條等技術(shù)結(jié)合，向高通量、操作簡(jiǎn)便、成本更低的方向發(fā)展，更適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)與應(yīng)用。LAMP反應(yīng)有兩對(duì)特異性引物，一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物，兩對(duì)特異性引物能有效地識(shí)別靶序列上的六個(gè)區(qū)域，使LAMP反應(yīng)有較高的特異性。

耐熱溶血毒素tdh和耐熱相關(guān)溶血毒素trh常被用作副溶血弧菌檢測(cè)的目標(biāo)基因，但是tdh和trh和其他細(xì)菌基因有很高的同源性［21］。DePaola等［22］發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌的特異性基因tlh在環(huán)境分離株中均可發(fā)現(xiàn)。LAMP反應(yīng)的內(nèi)外引物濃度過低會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不完全而使產(chǎn)物少，過高又會(huì)反應(yīng)不充分，一般情況下取外內(nèi)引物濃度比為1∶4～1∶8，體系中Mg2+影響聚合酶反應(yīng)活性，濃度過低，酶的活性降低，而濃度過高特異性則會(huì)相對(duì)的降低，加入甜菜堿可以使雙鏈DNA變得不穩(wěn)定，容易被解離成單鏈DNA，Bst酶的最適反應(yīng)溫度為65℃。本研究在這些理論基礎(chǔ)上對(duì)LAMP反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)特異性和靈敏度進(jìn)行了檢測(cè)。

本研究選擇副溶血弧菌的不耐熱溶血素tlh基因?yàn)槟康幕?，設(shè)計(jì)特異性引物。實(shí)驗(yàn)選擇外內(nèi)引物濃度比為1∶8，Mg2+反應(yīng)濃度為4 mmol/L，dNTPs濃度為3.5 mmol/L，反應(yīng)溫度為65℃。LAMP反應(yīng)可在1 h左右完成，同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌和單增李斯特菌等食源性致病菌行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，只有副溶血弧菌產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明，本研究建立的方法具有反應(yīng)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高，對(duì)于基因組DNA的檢測(cè)限約為5.45×101fg/μL，細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)限約為140 cfu/mL，這一結(jié)果與程曉艷［23］、徐芊等報(bào)道的檢測(cè)結(jié)果基本相符［24］，但是，優(yōu)于祝孺剛［25］、劉琦等［26］報(bào)道的PCR檢測(cè)方法。

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Optimize of Loop-mediated isothermal amplification technology in detection of Vibrio parahaemolyticus

JI Yi-fang1，HU Wen-zhong2，*，JIANG Ai-li2，F(xiàn)ENG Ke3
（1.College of Food Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China；2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China；3.College of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China）

In this study，two pairs of primers were designed according to the heat-sensitive hemolysin gene tlh of V.parahaemolyticus and the LAMP amplification reaction conditions were optimized to develop the rapid detection method of V.parahaemolyticus，and verified the specificity and sensitivity.These results suggested that the LAMP mixture containing concentration ratio for outer primer and inner primer was 1 to 8，4 mmol/L Mg2+，3.5 mmol/L dNTPs，performed at 65℃ for 1 h.No crossreaction was found with other common bacteria which showed a good specificity.The detection limits of LAMP assay and pure cultures were 5.45×101fg/μL LAMP mixture of genomic DNA and 140 cfu/mL respectively.The detection limit of V.parahaemolyticus in food samples were 2.8×102cfu/mL.The result indicated that LAMP had the advantage of rapidity，specificity，and sensitivity.

Vibrio parahaemolyticus；LAMP；seafood；tlh

TS201.3

A

1002-0306（2015）20-0059-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.003

2015－02－02

紀(jì)懿芳（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：343158635@qq.com。

胡文忠（1959-），男，教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172009）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD38B05）；大連市金州新區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012-A1-049）。