史強(qiáng)強(qiáng)，黨　軍，苑　祥，岳會(huì)蘭，王啟蘭（.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，中國科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧80008；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京00049）

黃綠蜜環(huán)菌菌種分離及人工培養(yǎng)研究

史強(qiáng)強(qiáng)1，2，黨軍1，苑祥1，2，岳會(huì)蘭1，王啟蘭1
（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，中國科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810008；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

采用組織分離法從黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體的菌蓋與菌柄結(jié)合處分離菌種，經(jīng)多次純化，獲得純化的黃綠蜜環(huán)菌菌株。以分離的黃綠蜜環(huán)菌母種為材料，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，以菌落直徑及菌絲體干重為指標(biāo)，研究不同碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：黃綠蜜環(huán)菌菌絲最優(yōu)化培養(yǎng)條件為馬鈴薯浸出液20%、黃豆芽浸提液10%、KH2PO40.3‰、VB1+VB21 mg/L（等比例），在此培養(yǎng)條件下，黃綠蜜環(huán)菌菌絲體干重可達(dá)6.5 mg/mL。

黃綠蜜環(huán)菌，菌種分離，人工培養(yǎng)

黃綠蜜環(huán)菌（Armillaria luteo-virens），又名黃蘑菇，黃環(huán)菌，屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataceae），蜜環(huán)菌屬（Armillaria）。主要分布于我國青海、四川、甘肅、西藏等地區(qū)，是高山草地上的一種名貴的珍稀野生食用菌［1-4］。黃綠蜜環(huán)菌目前仍處于野生狀態(tài)，資源量非常有限，被青海和西藏區(qū)的居民廣泛采食。由于黃綠蜜環(huán)菌集食用、藥用和保健功能于一身，深受消費(fèi)者的青睞，市場(chǎng)需求量逐年增加，目前市場(chǎng)干品價(jià)可達(dá)1000元/kg，出口價(jià)更加昂貴。黃綠蜜環(huán)菌被公認(rèn)為是最有開發(fā)利用價(jià)值的野生菌類之一。對(duì)于黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)條件的初步研究［6］、人工培養(yǎng)條件方面的研究［7-8］及深層發(fā)酵條件的研究［9］，已有相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。但是人工培養(yǎng)對(duì)其有效成分的開發(fā)研究尚屬起步階段，對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的人工培養(yǎng)也沒有系統(tǒng)的研究。如何經(jīng)濟(jì)有效地進(jìn)行生物活性組分的提取、利用，已成為黃綠蜜環(huán)菌深加工的重要研究?jī)?nèi)容之一。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黃綠蜜環(huán)菌采自青海省海北州、果洛、黃南、玉樹等地的黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體，除去子實(shí)體表面的異物及菌柄基部的泥土，裝入編號(hào)的牛皮紙袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室備用；葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉天津市永大化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、（NH4）2SO4、FeSO4、KNO3、NH4NO3、NH4Cl、CaCl2、VB1、VB2、復(fù)合VB上?；瘜W(xué)試劑總廠；蛋白胨、酵母粉、瓊脂北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；馬鈴薯、黃豆芽新鮮市售。

AG204型電子天平METTLER TOLEDO公司；LHS-250SC型恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；HVE-90型高壓滅菌器日本HIRAYAMA公司；BCM-1000型超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；BHF-T型生物顯微鏡日本OLYMBUS公司；UPI-1-520T型超純水器成都超純科技有限公司；DZF-6050型真空干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HYG-A型全溫?fù)u瓶柜太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1黃綠蜜環(huán)菌菌種分離與純化

1.2.1.1分離純化用培養(yǎng)基配方去皮馬鈴薯浸出汁20%，葡萄糖2%，酵母浸出汁1‰，微量鹽，微量復(fù)合VB，瓊脂1.8%，蒸餾水，pH6.5。

1.2.1.2分離純化黃綠蜜環(huán)菌菌種采用組織分離法從子實(shí)體的菌蓋與菌柄結(jié)合處分離菌種。從中選取無污染、生長(zhǎng)健壯的菌株，經(jīng)多次純化，最終獲得純化的黃綠蜜環(huán)菌菌株4株，經(jīng)鑒定為黃綠蜜環(huán)菌菌株。分別編號(hào)為AM-H（海北）、AM-N（黃南）、AM-G（果洛）、AM-Y（玉樹），接種于試管斜面。從分離純化的菌種中篩選出長(zhǎng)勢(shì)及適應(yīng)性較好的菌株，作為人工培養(yǎng)材料。

1.2.2黃綠蜜環(huán)菌菌種的培養(yǎng)及其適應(yīng)性研究以分離的黃綠蜜環(huán)菌母種（AM-H）為材料，經(jīng)過PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）多次傳代培養(yǎng)，獲得AM-H菌株。

利用平板培養(yǎng)測(cè)定菌落生長(zhǎng)速度（以培養(yǎng)15 d最大直徑Φ mm為指標(biāo)）；通過100 mL液體培養(yǎng)基培養(yǎng)測(cè)定菌絲體生產(chǎn)量（以培養(yǎng)15 d所獲得的菌絲體干重為指標(biāo)），研究不同碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1不同碳、氮源對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長(zhǎng)的影響

在無碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基（硝酸銨0.3%、硫酸鎂0.3‰，氯化鈣0.15‰，磷酸二氫鉀0.3‰，硫酸亞鐵0.05‰，復(fù)合VB微量，蒸餾水，pH6.5）中，分別添加2%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、馬鈴薯作為碳源，連續(xù)培養(yǎng)15 d，測(cè)定菌絲體生長(zhǎng)的直徑，然后將菌絲體用蒸餾水清洗干凈，洗去表面粘附的培養(yǎng)基，烘干，稱重，得菌絲體干重，考察不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

大學(xué)生在日常行為中會(huì)直接體現(xiàn)出學(xué)生對(duì)于社會(huì)主義核心價(jià)值觀的堅(jiān)持。所以大學(xué)生的日常行為規(guī)范是實(shí)行核心價(jià)值觀的基礎(chǔ)前提。教師要引導(dǎo)學(xué)生在日常生活中規(guī)范自己的行為，只有這樣才能讓學(xué)生做到修身立德。比如學(xué)生在日常生活中可以做到與其它同學(xué)和睦相處，不要尋釁滋事，這就做到了核心價(jià)值中的“和諧”，又比如說教師可以引導(dǎo)學(xué)生時(shí)刻有一顆“法治”的心，在遇到打架、偷竊或者其它違法事件時(shí)要主動(dòng)報(bào)案，讓法律來處理問題，不要選擇避讓無視〔6〕。

在無氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基（葡萄糖1.5%、硫酸鎂0.3‰，氯化鈣0.15‰，磷酸二氫鉀0.3‰，硫酸亞鐵0.05‰，復(fù)合VB微量，蒸餾水，pH6.5）中，分別添加0.4%的蛋白胨、10%黃豆芽浸提液、0.3%硝酸銨、0.2%硝酸鉀、0.2%氯化銨作為氮源，連續(xù)培養(yǎng)15 d，測(cè)定菌絲體生長(zhǎng)的直徑，然后將菌絲體用蒸餾水清洗干凈，洗去表面粘附的培養(yǎng)基，烘干，稱重，得菌絲體干重，考察不同氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響。

1.2.3.2無機(jī)鹽及維生素對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長(zhǎng)的影響在沒有無機(jī)鹽及維生素的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中（葡萄糖1.5%、硝酸銨0.3%、蒸餾水，pH6.5），分別加入0.3‰的硫酸鎂、硫酸銅、硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鋅，以無礦質(zhì)元素的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為對(duì)照，連續(xù)培養(yǎng)15 d，測(cè)定菌絲體生長(zhǎng)的直徑，然后將菌絲體用蒸餾水清洗干凈，洗去表面粘附的培養(yǎng)基，烘干，稱重，得菌絲體干重，考察無機(jī)鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

在培養(yǎng)基中，分別加入1 mg/L的VB1、VB2、VB6、VB1+ VB2（等比例）、復(fù)合VB，以不添加維生素為對(duì)照，連續(xù)培養(yǎng)15 d，測(cè)定菌絲體生長(zhǎng)的直徑，然后將菌絲體用蒸餾水清洗干凈，洗去表面粘附的培養(yǎng)基，烘干，稱重，得菌絲體干重，考察維生素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.4黃綠蜜環(huán)菌培養(yǎng)條件優(yōu)化根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取馬鈴薯為碳源；黃豆芽為氮源；KH2PO4+ MgSO4為無機(jī)鹽；VB1+VB2（等比例）為生長(zhǎng)因子。按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用正交設(shè)計(jì)助手設(shè)計(jì)L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，見表1，連續(xù)培養(yǎng)15 d，將菌絲體表面的培養(yǎng)基用蒸餾水清洗干凈，烘干，稱重，記錄菌絲體干重。

表1　黃綠蜜環(huán)菌培養(yǎng)條件優(yōu)化因素水平表Table 1　Orthogonal factors and levels table of Armillarialuteo-rivens

1.2.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理采用正交設(shè)計(jì)助手軟件。

2　結(jié)果與討論

2.1菌種分離與純化

來自不同地方的黃綠蜜環(huán)菌，其菌絲體在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)長(zhǎng)勢(shì)有顯著的差異，其中以海北分離到的黃綠蜜環(huán)菌菌株（AM-H）的長(zhǎng)勢(shì)最好，黃南（AM-N）和玉樹（AM-Y）的次之，果洛分離的菌株（AM-G）最差，結(jié)果見表2。

表2　黃綠蜜環(huán)菌菌株形態(tài)特征Table 2　The morphological characteristics of Armillarialuteo-rivens strain

2.2.1不同碳、氮源對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長(zhǎng)的影響黃綠蜜環(huán)菌菌絲體對(duì)碳源的利用以馬鈴薯最好，其他依次為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，可溶性淀粉最差。菌絲體對(duì)氮源的利用以黃豆芽最好，其他依次為硝酸銨、氯化銨、蛋白胨，硝酸鉀最低，結(jié)果見圖1、圖2。

2.2.2無機(jī)鹽及維生素對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長(zhǎng)的影響單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：菌絲體對(duì)磷酸二氫鉀利用最好，其他依次為硫酸銅、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅。菌絲體對(duì)維生素的利用以VB1+VB2（等比例）最好，其次VB1、VB2、復(fù)合VB，對(duì)VB6的利用最差，結(jié)果見圖3、圖4。

圖1　不同碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響Fig.1　The impacts of diverse carbon source on mycelium growth

圖2　不同氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響Fig.2　The impacts of diverse nitrogen source on mycelium growth

圖3　無機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響Fig.3　The impacts of inorganic salt on mycelium growth

圖4　維生素對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響Fig.4　The impacts of vitamin on mycelium growth

2.3黃綠蜜環(huán)菌培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

由表3可見，對(duì)于黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長(zhǎng)的影響，碳源為A1＞A2＞A3、氮源為B1＞B2＞B3、無機(jī)鹽為C1＞C3＞C2、維生素為D1＞D2＞D3。結(jié)果表明：碳源對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長(zhǎng)的影響最大，其他依次為氮源、維生素、無機(jī)鹽。黃綠蜜環(huán)菌菌絲培養(yǎng)最優(yōu)化培養(yǎng)條件為A1B1C1D1，即馬鈴薯浸出液20%、黃豆芽浸提液10%、KH2PO40.3‰、VB1+VB2（等比例）1 mg/L、蒸餾水1000 mL、pH6.5、培養(yǎng)溫度25℃。

表3　黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3　The results of orthogonal experiment of Armillarialuteo-rivens mycelium

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最優(yōu)培養(yǎng)條件下即：馬鈴薯浸出液20%、黃豆芽浸提液10%、KH2PO40.3‰、VB1+VB2（等比例）1 mg/L、蒸餾水1000 mL、pH6.5、培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌，進(jìn)行三批工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4，菌絲體平均收率為6.5 mg/mL。工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明以上工藝為最優(yōu)化工藝。

表4　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 4　The test of process validation

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在參考以往有關(guān)研究的基礎(chǔ)上，對(duì)黃綠蜜環(huán)菌人工培養(yǎng)所需的碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素、pH及培養(yǎng)溫度進(jìn)行綜合研究，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)得到黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)的最優(yōu)化條件為：馬鈴薯浸出液20%、黃豆芽浸提液10%、KH2PO40.3‰、VB1+VB2（等比例）1 mg/L。本實(shí)驗(yàn)為解決野生黃綠蜜環(huán)菌資源量問題提供了理論依據(jù)。但是本文以菌落的直徑大小和菌絲體干重作為考量菌種生長(zhǎng)的指標(biāo)，而對(duì)于菌絲體的化學(xué)組成及其品質(zhì)評(píng)價(jià)未做探討。所以，下一步實(shí)驗(yàn)有必要對(duì)黃綠蜜環(huán)菌人工培養(yǎng)的菌絲體與野生黃綠蜜環(huán)菌的化學(xué)成分、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值之間的差異進(jìn)行深入研究。

［1］刁治民.青海草地黃綠蜜環(huán)菌生態(tài)學(xué)特性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值研究［J］.中國食用菌，1997，16（4）：21-22.

［2］刁治民.黃綠蜜環(huán)菌生理特性的初步研究［J］.微生物學(xué)雜志，1997，17（1）：14-17.

［3］王啟蘭，姜文波，陳波.黃綠蜜環(huán)菌蘑菇圈生長(zhǎng)對(duì)土壤及植物群落的影響［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2005，24（3）：269-272.

［4］李世峰，陳桂琛，畢玉蓉.兩種野生食用菌抗氧化及抗腫瘤活性研究［J］.中國食用菌，2005，24（3）：58-63.

［5］黃年來.黃綠蜜環(huán)菌的分類地位和特征特性［J］.食用菌，1995，12（6）：11.

［6］柳煥章，王賀祥，劉慶紅，等.黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)條件初探［J］.中國食用菌，2007，26（4）：16-19.

［7］周連玉，朱莉莉，鄧旭武，等.黃蘑菇深層發(fā)酵條件研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，36（1）：110-112.

［8］魏永林.野生黃蘑菇人工栽培實(shí)驗(yàn)初探［J］.青海氣象，2002，（2）：19～24.

［9］李渝珍.青海野生黃綠蜜環(huán)菌人工馴化技術(shù)途徑的探討［J］.青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2005（1）：74-76.

Study on the separation and domestication of Armillarialuteo-rivens strain

SHI Qiang-qiang1，2，DANG Jun1，YUAN Xiang1，2，YUE Hui-lan1，WANG Qi-lan1
（1.Northwest Institute of Plateau Biology，CAS，Key Laboratory of Tibetan Medicine Research，CAS，Xining 810008，China；2.University of Chinese Academy of Science，Beijing 100049，China）

With tissue-isolate method，the Armillaria luteo-rivens strain was isolated from the juncture between stipe and pileus of its fruit body.The purified strain was obtained after repeated purification.The strain as experimental material，the colony diameter and mycelia yield were taken as indexes to study the influence of mycelia growth by different carbon source，nitrogen source，inorganic salt，vitamin，and were carried out through the single factor test and orthogonal test.The result showed that the optimal culture condition of Armillarialuteorivens was potato 20%，extract of soybean sprouts 10%，KH2PO40.3‰，VB1+VB21 mg/L（proportion）.Under this culture condition，the mycelia yield was up to 6.5 mg/mL.

Armillaria luteo-rivens；strain separation；artificial domestication

TS201.3

A

1002-0306（2015）20-0180-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.029

2014－12－23

史強(qiáng)強(qiáng)（1989-），男，碩士研究生，研究方向：微生物天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail：shiqq89@126.com。

王啟蘭（1964-），女，副研究員，研究方向：微生物天然產(chǎn)物化學(xué)研究，E-mail：wql@nwipb.cas.cn。

青海省高新技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃（2012-G-218）。