王琪 尹躍平 龔匡隆

梅毒螺旋體不同接種途徑對(duì)家兔致病性研究初探

王琪 尹躍平 龔匡隆

目的 探討不同接種途徑建立的梅毒家兔模型的發(fā)病及免疫應(yīng)答情況。方法 20只家兔隨機(jī)分為睪丸接種組及背部皮內(nèi)接種組，每組10只。睪丸接種組家兔睪丸注射2×107梅毒螺旋體Nichols株。背部皮內(nèi)接種組家兔背部剃毛后選取6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行皮內(nèi)注射，6個(gè)點(diǎn)共注射2×107梅毒螺旋體Nichols株。觀察兩組家兔的臨床癥狀及血清學(xué)反應(yīng)情況。結(jié)果 睪丸接種組接種后第8天，睪丸開始腫大變硬，13～16 d腫大最為明顯，之后逐漸縮小，至接種后28 d所有家兔睪丸回縮，觸診未見腫大變硬；發(fā)病2個(gè)月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)其他部位出現(xiàn)皮損。背部皮內(nèi)接種組接種后7 d，接種部位皮膚出現(xiàn)紅腫，15～45 d皮損紅腫最為明顯，且出現(xiàn)潰瘍，有3只家兔共12個(gè)接種點(diǎn)的皮膚發(fā)生潰瘍，暗視野檢查陽性，觸診呈軟骨樣硬度。睪丸接種組接種后（14.50±1.08）d時(shí)臨床癥狀最為明顯，皮內(nèi)接種組（29.00±10.30）d時(shí)臨床癥狀最為明顯，兩組比較，t＝5.02，P＜0.05。兩組家兔快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）最高滴度分布經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），睪丸接種組滴度高于背部皮內(nèi)接種組。結(jié)論 梅毒螺旋體接種家兔不同部位，引起家兔不同的臨床癥狀及免疫反應(yīng)。睪丸接種組RPR陽性時(shí)間早，且滴度高。背部皮內(nèi)接種組的臨床癥狀類似于人類一期梅毒硬下疳表現(xiàn)。

梅毒；蒼白密螺旋體；疾病模型，動(dòng)物；兔

梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）尚不能人工培養(yǎng)，限制了對(duì)梅毒的深入研究［1］。梅毒的臨床治療藥物主要是青霉素［2］，但有些過敏患者需要選擇其他替代藥物。為了篩查或驗(yàn)證藥物的有效性，建立梅毒螺旋體藥效評(píng)價(jià)模型至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，Tp可在猿猴、小鼠、倉鼠、豚鼠及家兔體內(nèi)繁殖［3-4］。其中家兔睪丸接種可獲得大量Tp，利于菌種的收集與保存，是目前研究常用的梅毒感染動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)擬通過Tp的不同接種途徑探討梅毒家兔模型的發(fā)病及免疫應(yīng)答情況，為建立梅毒螺旋體藥效評(píng)價(jià)模型提供依據(jù)。

資料與方法

一、資料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：睪丸成熟的純種新西蘭雄兔（南京金陵種兔場(chǎng)；動(dòng)物合格證號(hào)0897），20只，體重2.8～3.5 kg，兔齡3個(gè)月左右，飼養(yǎng)于18～22℃的IVC兔籠中，飼料（南京青紫蘭生物科技有限公司）及飲水均不含抗生素。

2.菌株：保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所參比實(shí)驗(yàn)室的Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株。

3.試劑：快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）試劑盒（上?？迫A生物工程股份有限公司）；梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）試劑（珠海麗珠股份有限公司）；正常家兔血清鹽溶液（NRS鹽溶液，生理氯化鈉溶液與正常家兔血清混合）為實(shí)驗(yàn)室自制。

二、方法

1.Tp菌懸液制備：取2個(gè)保存于液氮中的梅毒兔模型睪丸，將睪丸沿縱線方向切成10多個(gè)小片，但不完全切開（每個(gè)小片呈蝴蝶形）。之后放入約10 ml 20%NRS鹽溶液，用無菌紗布蓋住燒杯口后，水平搖晃燒杯將液體混勻，并用鑷子擠壓睪丸以使更多的Tp溶于鹽溶液中，暗視野觀察到Tp進(jìn)行接種，共接種2只家兔。接種后隔3 d觸診睪丸。睪丸腫大變硬后每日觸診睪丸。待睪丸腫大及硬度連續(xù)3 d無變化時(shí)，注射空氣處死家兔，75%乙醇消毒睪丸，取下睪丸。以同樣方法將睪丸制作成菌懸液。連續(xù)傳代，當(dāng)睪丸菌懸液至（1～5）×107Tp/ml［5］時(shí)停止傳代。取4個(gè)滿足實(shí)驗(yàn)要求的睪丸置于A、B兩個(gè)不同的燒杯中，每個(gè)燒杯中各2個(gè)睪丸。A燒杯中放入約60 ml 20%NRS鹽溶液制作菌懸液，暗視野顯微鏡觀察每視野約50個(gè)Tp［5］。B燒杯中加入24ml50% NRS鹽溶液制備Tp菌懸液［6］，暗視野觀察每視野約120個(gè)Tp。A、B兩燒杯菌懸液備好后需1 h內(nèi)接種家兔。

2.感染方法：取20只正常家兔，稱重后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將其隨機(jī)分為睪丸接種組及背部皮內(nèi)接種組，每組10只。實(shí)驗(yàn)前每只家兔耳緣靜脈取血做RPR及TPPA檢測(cè)，確定其未感染梅毒螺旋體。睪丸接種組：使用安爾碘消毒睪丸，每個(gè)睪丸注射A燒杯中的菌懸液1.5 ml（1×107Tp），每只家兔注射2×107Tp。背部皮內(nèi)接種組：背部剃毛后選擇6個(gè)點(diǎn)，使用苦味酸溶液對(duì)6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，每個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射B燒杯中的菌懸液0.2 ml（0.35×107Tp），每只家兔注射2×107Tp。

3.家兔感染狀況觀察：本實(shí)驗(yàn)為期2個(gè)月。

（1）家兔大體情況觀察：每日觀察家兔精神及飲食狀況。通過敲擊兔籠觀察家兔對(duì)刺激的反應(yīng)，確定其有無亢奮或消沉，若對(duì)刺激無反應(yīng)，則家兔精神低沉；若反應(yīng)激烈，則家兔精神亢奮；每只家兔每日喂食50 g/kg兔糧，隔日觀察兔糧剩余情況，確定有無厭食或貪食。每周測(cè)量家兔體重。

（2）臨床癥狀觀察：每2天觸診睪丸接種組家兔睪丸，根據(jù)睪丸腫大變硬、回縮狀況及潰瘍發(fā)生情況將睪丸發(fā)病分級(jí)（表1）。每2天觀察背部皮內(nèi)接種組家兔背部皮損發(fā)展情況，根據(jù)皮損腫大的寬度、高度及是否發(fā)生潰瘍將皮損分級(jí)（表1）。

表1 梅毒螺旋體不同接種途徑感染的兩組家兔臨床癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

（3）家兔血清學(xué)檢測(cè)：每2天取家兔耳緣靜脈血1 ml于真空抗凝管中，離心后取血漿，按試劑操作說明書及標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行RPR及TPPA試驗(yàn)［7］。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件包，兩組比較，計(jì)量資料使用t檢驗(yàn)，RPR滴度分布使用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α＝0.05。

結(jié)果

一、家兔大體情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩組家兔飲食情況未見異常。2只睪丸接種組家兔及1只背部接種組家兔出現(xiàn)精神亢奮，其余17只家兔精神狀態(tài)未見異常。兩組家兔體重分別增加（0.85±0.19）kg及（0.75±0.22）kg，兩組比較，t=1.081，P=0.29。

二、家兔臨床表現(xiàn)

感染確立的簡(jiǎn)單指標(biāo)：睪丸組家兔睪丸腫大變硬無回縮為感染成功；皮內(nèi)接種組家兔接種部位出現(xiàn)紅斑或潰瘍?yōu)榻臃N成功。兩組家兔的發(fā)病情況見表2。睪丸接種組接種后第8天睪丸開始腫大變硬，13～16 d腫大最為明顯，之后逐漸縮小，至接種后28 d所有家兔睪丸回縮，觸診未見腫大變硬。其中有1個(gè)睪丸發(fā)生潰瘍，取組織液暗視野檢查，可見到Tp。觀察的2個(gè)月期間，未捫及腘窩淋巴結(jié)腫大。將家兔處死后對(duì)腘窩淋巴結(jié)［5］進(jìn)行暗視野檢查，未見到Tp，發(fā)病2個(gè)月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)其他部位出現(xiàn)皮損。

表2 梅毒螺旋體不同接種途徑感染的兩組家兔臨床癥狀發(fā)生情況

背部皮內(nèi)接種組接種后7 d，接種部位皮膚出現(xiàn)紅腫，15～45 d皮損紅腫最為明顯，且出現(xiàn)潰瘍，有3只家兔共12個(gè)接種點(diǎn)的皮膚發(fā)生潰瘍，暗視野檢查陽性，觸診呈軟骨樣硬度，觸診時(shí)未見家兔有任何不適反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍有10個(gè)接種點(diǎn)皮損未消退，其中Ⅰ級(jí)皮損6個(gè)，Ⅱ級(jí)皮損4個(gè)。

睪丸接種組與背部皮內(nèi)接種組臨床癥狀最明顯時(shí)間分別為（14.50±1.08）d及（29.00±10.30）d，兩組比較，t=5.026，P=0.016。

三、RPR及TPPA結(jié)果

睪丸接種組接種后4 d RPR陽性，之后滴度逐漸升高，4 d后TPPA全部陽性。皮內(nèi)接種組接種后12 d RPR開始陽性，之后滴度逐漸升高，7 d后TPPA全部陽性。兩組家兔血清RPR滴度最高值分布見表3。經(jīng)兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)，P＜0.05，兩組的滴度分布不同，睪丸接種組的滴度高于皮內(nèi)接種組。

討論

梅毒螺旋體不易在體外培養(yǎng)。將Tp接種于家兔睪丸中可以獲得大量的Tp，將兔睪丸保存在液氮中數(shù)年仍有致病力［8］。

本研究采用相同菌量Tp接種于家兔的不同部位，發(fā)現(xiàn)睪丸接種組家兔臨床癥狀最明顯時(shí)間為13～16 d，與國外文獻(xiàn)中報(bào)道的9～11 d不同［5］。家兔臨床癥狀發(fā)生率為95%，睪丸潰瘍發(fā)生率為5%，其他睪丸外觀良好。大部分家兔睪丸可以發(fā)展到Ⅲ級(jí)水平。接種2個(gè)月后未見全身其他部位發(fā)生皮損。背部皮內(nèi)接種組家兔臨床癥狀發(fā)生率約為61.7%，其潰瘍發(fā)生率為20%，較睪丸接種組高，皮損呈軟骨樣硬度，擠壓皮損未見家兔有任何不適，推測(cè)皮損為無痛性潰瘍，類似人類的一期梅毒硬下疳的表現(xiàn)。之后皮損逐漸好轉(zhuǎn)，但觀察2個(gè)月，未見二期梅毒表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)期間定期觸診皮內(nèi)接種組家兔睪丸未見睪丸腫大。

表3 梅毒螺旋體不同接種途徑感染的兩組家兔血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）最高滴度分布情況

與睪丸接種途徑相比，皮下接種組家兔的RPR及TPPA出現(xiàn)的時(shí)間晚，RPR滴度低?？梢娡ㄟ^睪丸接種途徑能更快地刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答。睪丸接種組家兔在接種4 d后已有家兔RPR陽性，與人體RPR陽性出現(xiàn)時(shí)間相似［9］。

以上結(jié)果表明，兩種接種途徑對(duì)家兔的致病性有明顯不同。睪丸接種13～16 d后，1個(gè)睪丸大約可孵育5×109Tp［5］，通過這種接種途徑可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量Tp。并且其免疫應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)烈，速度快。在進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)時(shí)，有利于對(duì)比用藥前后的免疫應(yīng)答情況，了解藥物的有效性。但其臨床癥狀異于人類梅毒的表現(xiàn)，在一定程度上限制了此種模型的應(yīng)用。背部接種Tp，臨床表現(xiàn)類似于人類一期梅毒硬下疳的表現(xiàn)。在進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)時(shí)，可模擬人類梅毒發(fā)病情況進(jìn)行觀察。但其臨床癥狀發(fā)生率低，僅為61.7%，且其免疫反應(yīng)強(qiáng)度不等，速度慢，不利于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集。

［1］Liu L,Xie Y,Dai Z,et al.Establishment and evaluation of a one-step microplate chemiluminescence immunoassay to detect IgG antibody againstTreponema pallidum［J/OL］.J Clin Lab Anal.doi:10.1002/ jcla.21799.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu+L+ Xie+Y+Dai+Z.［published online ahead of print Oct 2,2014］.

［2］Tipple C,Jones R,McClure M,et al.RapidTreponema pallidumclearance from blood and ulcer samples following single dose benzathine penicillin treatment of early syphilis［J/OL］.PLoS Negl Trop Dis,2015,9（2）:e0003492［2015-03-16］.http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4336135/

［3］Kajdacsy-Balla A,Howeedy A,Bagasra O.Experimental model of congenital syphilis［J］.Infect Immun,1993,61（8）:3559-3561.

［4］Wicher V,Wicher K.Pathogenesis of maternal-fetal syphilis revisited［J］.Clin Infect Dis,2001,33（3）:354-363.

［5］Lukehart SA,Marra CM.Isolation and laboratory maintenance ofTreponema pallidum［J］.Curr Protoc Microbiol,2007,Chapter 12: Unit 12A.1.

［6］Johnson RC,Bey RF,Wolgamot SJ.Comparison of the activities of ceftriaxone and penicillin G against experimentally induced syphilis in rabbits［J］.Antimicrob Agents Chemother,1982,21（6）:984-989.

［7］尹躍平.性病防治培訓(xùn)手冊(cè)（學(xué)員用書）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:17-25.

［8］Potomski J,Metzger M,Smogór W,et al.Effect of freezing conditions in liquid nitrogen on biological properties ofTreponema pallidum［J］.Arch Immunol Ther Exp（Warsz）,1979,27（1-2）:285-305.

［9］Peeling RW,Ye H.Diagnostic tools for preventing and managing maternal and congenital syphilis:an overview［J］.Bull World Health Organ,2004,82（6）:439-446.

Pathogenicity ofTreponema palliduminoculated through different routes in rabbits:a preliminary study

Wang Qi,Yin Yueping,Gong Kuanglong.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China
Corresponding author:Yin Yueping,Email:yinyp@ncstdlc.org

ObjectiveTo observe clinical manifestations and immune responses in rabbit models of syphilis established by inoculation withTreponema pallidumthrough different routes.MethodsA total of 20 rabbits were randomly and equally divided into two groups:testis-inoculated group injected withTreponema pallidum（Tp）suspensions into the testes,back-inoculated group intracutaneously injected with Tp suspensions at six sites on the shaved back.All the rabbits

a single injection with the total injection amount of Tp（Nichols strains）being 2× 107in both groups.Clinical symptoms and immune responses were evaluated in both groups every other day.Statistical analysis was carried out by a two-samplet-test and rank sum test with the SPSS 20.0 software.ResultsOn day 8 after the inoculation,the testes of rabbits in the testis-inoculated group started to swell with induration,and the swelling was most severe during days 13-16.Afterwards,the testes gradually diminished,and returned to normal in size without swelling or hardening on day 28.No skin lesions occurred in the other sites in the testis-inoculated group within 2 months after the inoculation.Erythematous swelling occurred at inoculation sites on day 7 after inoculation in the backinoculated group,which was most obvious between days 15 and 45.Moreover,cartilage-like indurated ulcers were observed at 12 inoculation sites in 3 rabbits in the back-inoculated group,and dark-field examination of the ulcers showed the presence of Tp.There was a significant difference in the time required for the severity of lesions to peak between the testis-inoculated group and back-inoculated group（14.50±1.08 days vs.29.00±10.30 days,t＝5.02,P＜0.05）.Rank sum test showed significant differences in the distribution of highest RPR titers between the two groups（P＜0.05）,and RPR titers were higher in the testis-inoculated group than in the back-inoculated group.Conclusions The injection of Tp suspensions at different sites can cause different clinical symptoms and immune responses in rabbits.RPR turned positive earlier with a higher titer in the testis-inoculated group compared with the back-inoculated group.The clinical manifestations in the back-inoculated group were similar to those of chancre in primary syphilis in human.

Syphilis;Treponema pallidum;Disease models,animal;Rabbits

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.09.006

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所

尹躍平，Email：yinyp@ncstdlc.org

2015-01-15）

（本文編輯：顏艷）