王銀娟 顧華 郭美華 涂穎 何黎

·論著·

黃褐斑患者皮損及血液中Toll樣受體2和4的表達(dá)

王銀娟 顧華 郭美華 涂穎 何黎

目的 探討Toll樣受體（TLR）2和4與黃褐斑發(fā)病的相關(guān)性。方法 黃褐斑患者和健康對(duì)照各40例，采集外周血，并收集其中10例黃褐斑及10例健康對(duì)照者皮損，用RT-PCR方法檢測(cè)血樣及皮損中TLR2和4 mRNA的表達(dá)，免疫組化觀察TLR2和4在皮損中的表達(dá)及分布，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 黃褐斑皮損中TLR2和TLR4在mRNA水平表達(dá)（分別為9.72±2.93，9.52±2.88）明顯高于健康對(duì)照（分別為5.10±2.69，4.77±1.90），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別t=3.67、4.36，均P＜0.01）。40例黃褐斑患者及40例健康對(duì)照外周血中TLR2和TLR4的表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。免疫組化顯示：10例正常皮膚中6例表皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞均無(wú)TLR2表達(dá)，4例表皮基底層有TLR2弱陽(yáng)性表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)。10例黃褐斑皮損中有3例表皮全層均有TLR2陽(yáng)性表達(dá)，7例基底細(xì)胞層及棘層有TLR2陽(yáng)性表達(dá)，真皮淺層血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)TLR2表達(dá)。10例健康對(duì)照皮膚表皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞均未見(jiàn)TLR4表達(dá)。10例黃褐斑皮損基底細(xì)胞層均有TLR4強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，棘層弱陽(yáng)性表達(dá)，其中3例真皮淺層血管內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)陽(yáng)性TLR-4表達(dá)。結(jié)論 黃褐斑發(fā)病可能與局部皮膚TLR介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

黃褐斑；Toll樣受體；炎癥

黃褐斑為女性最常見(jiàn)的面部皮膚病之一，嚴(yán)重影響容貌，然而病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前認(rèn)為與紫外線、化妝品、妊娠、內(nèi)分泌紊亂、某些慢性疾病、某些藥物、睡眠質(zhì)量及遺傳等有關(guān)。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是一種天然免疫的分子家族，不僅在免疫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞表面表達(dá)，多種組織細(xì)胞，如，角質(zhì)形成細(xì)胞及黑素細(xì)胞均有TLR表達(dá)。以往研究證實(shí)，TLR在多種與炎癥相關(guān)的疾病，如，銀屑病、痤瘡、特應(yīng)性皮炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的發(fā)病機(jī)制中產(chǎn)生作用［1-3］。為了探討TLR介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在黃褐斑發(fā)病中的作用，我們研究TLR2和TLR4在黃褐斑患者及健康人皮損及血液中的表達(dá)。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2012年1月至2013年6月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科門(mén)診，根據(jù)黃褐斑的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，收集女性黃褐斑患者皮損10例，均為面頰部長(zhǎng)徑約1 cm的楔形皮損；另外收集女性色素痣切除皮損周圍正常皮膚樣本10例，均為女性面頰部長(zhǎng)徑約1 cm的楔形皮損。采集黃褐斑患者血樣40例為黃褐斑組，本院體檢中心健康血樣40例為健康對(duì)照組，均為女性。采集標(biāo)本過(guò)程中均排除其他系統(tǒng)疾病。黃褐斑組與健康對(duì)照組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

二、主要試劑和儀器

TLR2/TLR4抗體（美國(guó)Abnova公司），偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的二抗及DAB顯色劑（丹麥Dako公司），皮損/全血RNA提取試劑盒（美國(guó)Qiagen公司），RevertAidTMFirst Strand cDNA合成試劑盒（加拿大 Fermentas公司），SYBR Green Master（瑞士Roche公司），PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

三、方法

1.實(shí)時(shí)定量PCR：引物由廣州Invitrogen公司合成，序列：TLR2：上游 5′-ATCCTCCAATCAGGCT TCTCT-3′，下游 5′-GGACAGGTCAAGGCTTTTTAC A-3′；TLR4：上游 5′-AGTTGATCTACCAAGCCTTGA GT-3′，下游 5′-GCTGGTTGTCCCAAAATCACTTT-3′；GAPDH：上游 5′-AAAGGGTCATCATCTCTG-3′，下游5′-GCTGTTGTCATACTTCTC-3′。將約 0.1 g 皮膚組織加入Trizol裂解液中，冰浴研磨至無(wú)顆粒勻漿液，使用RNA提取試劑盒，通過(guò)核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA濃度。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒合成cDNA第一條鏈，定量PCR檢測(cè)。吸取抗凝管中的血液1.5 ml放入去酶離心管，提取總RNA，通過(guò)核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA濃度。用試劑盒合成cDNA第一條鏈，定量PCR檢測(cè)。

2.免疫組化：皮損常規(guī)石蠟組織包埋、切片，脫蠟至脫水。3%過(guò)氧化氫去離子水消化，枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)。正常羊血清封閉，室溫孵育。滴加單克隆TLR2/TLR4抗體孵育，繼以二抗。滴加生物素二抗，DAB顯色。水洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。結(jié)果判定：胞膜棕黃色染色判定為陽(yáng)性。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件作數(shù)據(jù)處理。各組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TLR2和TLR4在皮損中的表達(dá)

黃褐斑患者皮損中，TLR2和TLR4在mRNA水平表達(dá)（分別為9.72±2.93，9.52±2.88）明顯高于健康對(duì)照者（分別為 5.10±2.69，4.77±1.90），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.67、4.36，均 P ＜ 0.01），見(jiàn)表 1。免疫組化顯示，10例健康皮膚中6例表皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞均無(wú)TLR2表達(dá)（圖1），有4例表皮少量基底層細(xì)胞胞膜TLR2弱陽(yáng)性表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)（圖2）10例黃褐斑皮損中有3例表皮全層均有TLR2陽(yáng)性表達(dá)（圖3），7例僅基底細(xì)胞層及棘層胞膜有TLR2陽(yáng)性表達(dá)，真皮淺層血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)TLR2表達(dá)（圖4）。10例健康皮膚表皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞均未見(jiàn)TLR4表達(dá)；10例黃褐斑皮損基底層細(xì)胞胞膜均有TLR4強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，棘層弱陽(yáng)性表達(dá)（圖5），其中3例真皮淺層血管內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)陽(yáng)性TLR-4表達(dá)（圖6）。

二、TLR2和TLR4在血液中的表達(dá)

黃褐斑組與健康對(duì)照組比較，TLR2和TLR4表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

討 論

近年來(lái)，TLR在皮膚病中的研究成為熱點(diǎn)，其受微生物和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，主要通過(guò)識(shí)別病原微生物表面的病原體及配體，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，釋放大量炎癥因子［5-6］。其中TLR2和TLR4是一種具有廣譜識(shí)別能力的“模式”識(shí)別受體，主要識(shí)別革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的標(biāo)記蛋白，在防御表皮微生物的免疫反應(yīng)中起到重要作用［7］。TLR2主要見(jiàn)于單核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，TLR4主要見(jiàn)于巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。

關(guān)于黃褐斑的發(fā)病機(jī)制，以往研究主要集中在表皮層黑素細(xì)胞的數(shù)量、活力，以及黑素顆粒的分布上，內(nèi)在因素及外界因素對(duì)黑素細(xì)胞的刺激最終導(dǎo)致黑素細(xì)胞數(shù)量不變而黑素合成能力增加，包括局部微生態(tài)環(huán)境失衡，尤其是褐色素、枯黃色素的微球的顯著增加［8］，以及黑素細(xì)胞受到腫瘤壞死因子α、內(nèi)皮素、白三烯等炎癥介質(zhì)刺激后，可改變黑素細(xì)胞及一些免疫細(xì)胞的活性使黑素合成增加［9-11］研究 表 明 ， 黑素 細(xì) 胞 中 TLR1、2、3、4、6、7、9 在

圖1 健康皮膚表皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞均無(wú)表達(dá)（DAB染色×200）

圖2 健康皮膚表皮少量基底層細(xì)胞胞膜有少量棕色染色，TLR2弱

圖3 黃褐斑皮損表皮全層細(xì)胞胞膜均有棕色染色，TLR2陽(yáng)性表達(dá)（DAB染色×200）

圖4 黃褐斑皮損僅基底細(xì)胞層及棘層細(xì)胞胞膜有棕色染色，TLR2陽(yáng)性表達(dá)，真皮淺層血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)（DAB染色×200）

圖5 黃褐斑皮損基底層細(xì)胞胞膜均有TLR4棕色染色，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，棘層細(xì)胞胞膜淡棕色染色，弱陽(yáng)性表達(dá)（DAB染色×200）

圖6 黃褐斑皮損基底層細(xì)胞胞膜及真皮淺層血管內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)棕色染色，TLR-4呈陽(yáng)性表達(dá)表達(dá)（DAB染色×100）

表1 黃褐斑組與健康對(duì)照組皮損和血TLR2、4的檢測(cè)結(jié)果

陽(yáng)性表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)（DAB染色×200）mRNA水平上的表達(dá)，蛋白水平上證明TLR2、4、7和9的表達(dá)［12］。因此，我們推測(cè)，黃褐斑的炎癥反應(yīng)可能與TLR介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相關(guān)。

國(guó)外學(xué)者對(duì)健康人皮膚TLRl～5的分布情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)健康人表皮表達(dá)TLRl、TLR2、TLR5，而TLR3和TLR4幾乎檢測(cè)不到，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)健康人皮膚TLR2弱表達(dá)而無(wú)TLR4表達(dá)與國(guó)外研究結(jié)果類似［13］，而TLR2和TLR4在黃褐斑皮損中表達(dá)陽(yáng)性，黃褐斑患者的黑素細(xì)胞中TLR2和TLR4的表達(dá)相對(duì)健康人有所上調(diào)，提示黃褐斑的形成可能與TLR介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子，增加黑素的合成有關(guān)。研究結(jié)果顯示，紫外線誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞因子1，前列腺素及干細(xì)胞因子1分泌增多可使黑素細(xì)胞中黑素小體合成增多并促使其自角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)［14-15］。提示，紫外線誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在色素形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。另外，在一些炎癥疾病中，腫瘤壞死因子α、γ干擾素等炎癥因子也可上調(diào)Toll樣受體的表達(dá)［16］，提示黃褐斑皮損中TLR2和TLR4表達(dá)增加也可能與紫外線照射等刺激產(chǎn)生的炎癥因子升高有關(guān)。我們的結(jié)果還顯示，黃褐斑患者及健康人群血液TLR2和TLR4的mRNA表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示免疫反應(yīng)在黃褐斑的發(fā)病機(jī)制中無(wú)影響。

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Expressions of Toll-like receptors 2 and 4 in skin lesions and peripheral blood from patients with chloasma

Wang Yinjuan*,Gu Hua,Guo Meihua,Tu Ying,He Li.*Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,China.

ObjectiveTo investigate the relationship of Toll-like receptors （TLRs）2 and 4 with the occurrence of chloasma.MethodsPeripheral blood samples were collected from 40 patients with chloasma and 40 healthy human controls,and skin samples were also collected from the lesions of 10 of the patients and normal skin of 10 of the healthy controls.Real time （RT）-PCR was performed to measure the mRNA expressions of TLR2 and TLR4 in skin lesions and blood samples.An immunohistochemical test was conducted to observe the expressions of TLR2 and TLR4 in skin lesions.Statistical analysis was carried out byttest.ResultsThe expressions of TLR2 and TLR4 mRNAs were both significantly higher in skin lesions of the patients than in normal skin of the controls（9.72±2.93 vs.5.10±2.69,t=3.67,P＜0.01;9.52±2.88 vs.4.77±1.90,t=4.36,P＜0.01）,while no significant difference was found in the mRNA expressions of TLR2 or TLR4 in peripheral blood between the patients and controls（bothP＞0.05）.As the immunohistochemical test revealed,TLR2 was absent in both the epidermis and vascular endothelial cells in 6 normal control skin samples,weakly expressed in the basal layer of the epidermis but absent in vascular endothelial cells in 4 normal skin samples,and no TLR4 expression was observed in either the epidermis or vascular endothelial cells in these control skin samples.Among the 10 skin samples from chloasma lesions,3 showed TLR2 expression in the whole epidermis,7 in both basal cell layer and prickle cell layer but not in vascular endothelial cells in the superficial dermal layer,all showed strong TLR4 expression in the basal cell layer and weak TLR4 expression in the prickle cell layer,and 3 exhibited TLR4 expression in vascular endothelial cells in the superficial dermal layer.ConclusionTLR-mediated immune responses in local skin might be related to the occurrence of chloasma.

Chloasma;Toll-like receptors;Inflammation

He Li,Email:helikm2662@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.010

教育部2013年度創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（IRT13067）；云南省衛(wèi)生高層次人才培養(yǎng)計(jì)劃（L-201211）；2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)薇姿研究項(xiàng)目（V2012080514）

650032昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科（王銀娟、顧華、涂穎、何黎）；昆明醫(yī)科大學(xué)科技處（郭美華）

何黎，Email：helikm2662@126.com

2014-05-23）

（本文編輯：吳曉初）