石小峰沈福良張 強(qiáng)于園園張作法呂國英*

（1. 嘉興市潛福食品有限公司，浙江 嘉興314050；2. 嘉興市潛鑫食品有限公司，浙江 嘉興314050；3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，杭州 310021）

蛹蟲草原生質(zhì)體60CO輻射誘變選育高產(chǎn)多糖菌株的實驗

石小峰1沈福良1張 強(qiáng)2于園園2張作法3呂國英3*

（1. 嘉興市潛福食品有限公司，浙江 嘉興314050；2. 嘉興市潛鑫食品有限公司，浙江 嘉興314050；3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，杭州 310021）

蛹蟲草；原生質(zhì)體；輻射誘變；多糖

蛹蟲草Codyceps militaris （L.） Link，又稱北冬蟲夏草，是蟲草的模式菌種。蛹蟲草的功效成分和藥效，與野生冬蟲夏草相似［1，2］，可以作為野生冬蟲夏草的有效替代品。蛹蟲草含有多種活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗感染等多種藥理活性。蟲草多糖是一類高分子復(fù)合物，為蟲草的主要活性成分之一，是蟲草中含量最高的藥理活性物質(zhì)［3］。蟲草多糖主要存在于菌絲體中，研究提高菌絲體中多糖含量具有重要意義。

原生質(zhì)體技術(shù)是通過制備具有生物全能性的原生質(zhì)體，并結(jié)合誘變、雜交、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)培育變異新類型的生物技術(shù)［4］。輻射育種有著常規(guī)育種和雜交育種不可替代的特殊效應(yīng)，通過輻射誘發(fā)突變不僅可以改良品種，而且可以創(chuàng)造新的種質(zhì)資源。原生質(zhì)體60Co輻射誘變技術(shù)以其周期短、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)被廣泛采用。

我們通過對蛹蟲草的原生質(zhì)的60Co輻射誘變，選育出多糖含量高的優(yōu)質(zhì)菌株。進(jìn)一步開發(fā)利用蛹蟲草創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為蛹蟲草M，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所食用菌實驗室保存。溶壁酶，購自廣東省微生物研究所。蝸牛消化腺干粉，由嘉興市潛福食品有限公司提供。葡萄糖、苯酚、硫酸、硫酸鎂等均為分析純試劑。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%；液體培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯20%，葡萄糖2%；再生培養(yǎng)基（g/L）：在PDA培養(yǎng)基中添加蝸牛消化腺干粉20 g，MgSO4·7H2O 147.9 g。

1.3 方法

（1）菌絲培養(yǎng)。菌株的活化及擴(kuò)大培養(yǎng)，將冷藏的PDA斜面菌種轉(zhuǎn)接到平板中，放置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8天，然后轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5～6天，再連同培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)移至勻漿器中，并加入一定量的液體培養(yǎng)基，勻漿后分裝至預(yù)先裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，25 ℃靜置培養(yǎng)3 d備用。

（2）原生質(zhì)體制備與再生。0.2 g 溶壁酶溶于10 mL 0.6 mol/L的硫酸鎂溶液中，經(jīng)0.2 μm細(xì)菌過濾器過濾，制成酶液。過濾并收集液體培養(yǎng)的菌絲，用無菌水沖洗后再用無菌吸水紙吸干菌絲水分，將菌絲轉(zhuǎn)移到酶液中，輕微振蕩使其均勻分散，置于30 ℃、60 r/min 搖床中酶解3 h。用G-2 砂芯漏斗過濾除去酶解液中的殘留菌絲，將收集的濾液在4 ℃、3 000 r/min 條件下離心10 min，棄上清，沉淀，用0.6 mol/L 的硫酸鎂洗滌2～3次即得到純化的原生質(zhì)體。

（3）60Co輻射誘變處理。將原生質(zhì)體稀釋至適當(dāng)濃度用血球計數(shù)板計數(shù)，吸取200 μL經(jīng)稀釋的原生質(zhì)體懸液用不同60Co輻射劑量（30 Gy，50 Gy，100 Gy，150 Gy）分別處理30 min。

（4）變異菌株篩選。吸取100 μL誘變后的原生質(zhì)體懸液于再生培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻，25 ℃倒置培養(yǎng)7～10天可見再生菌落。挑選出一部分單菌落和部分雜交菌落，接種至PDA固體斜面培養(yǎng)基上。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7天。觀察菌絲體生長狀況，并與未誘變的對照組進(jìn)行比較。挑選出一部分與對照組有差異的菌株，接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵液的多糖含量。

（5）多糖測定。發(fā)酵液多糖含量的測定采用以下公式：發(fā)酵液總多糖含量—發(fā)酵液還原糖含量=胞外多糖含量。多糖測量方法采用苯酚-硫酸法，還原糖的測定采用DNS法。

2　結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體形態(tài)

取適量原生質(zhì)體置于40倍光鏡下進(jìn)行鏡檢，觀察形態(tài)。圖1中呈現(xiàn)黑點(diǎn)且四周透明的即為蛹蟲草原生質(zhì)體。還有一部分呈現(xiàn)條狀的為未酶解的菌絲體。

圖1 蛹蟲草原生質(zhì)體形態(tài)

2.2 誘變后再生菌株的生長情況

從再生培養(yǎng)基上挑選出一部分單菌落接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后觀察菌株的生長情況和菌絲形態(tài)。結(jié)果（圖2）為：部分單菌落生長明顯快于其他菌株，且有部分菌株的菌絲體外形與其他組有顯著的不同。

圖260Co輻照誘變1周后各菌落生長情況

表1 篩選的菌株胞外多糖含量

2.3 胞外多糖含量

將菌絲體形態(tài)和長勢與對照組明顯不同的菌株接種于50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25 ℃恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)5～7天，隨后過濾菌絲體，測定干重，清液用于測量胞外多糖。結(jié)果（表1）可以看出，挑選的20株菌株中，多糖含量提高的有8株，其正突變率達(dá)40%；其中，13號菌株胞外多糖含量最高，為195.48 mg/g菌絲，比對照提高了46.2%。

3 討 論

微生物菌種選育是建立在遺傳和變異基礎(chǔ)上的，一個菌種的生物合成物的產(chǎn)量和質(zhì)量取決于該菌種內(nèi)部遺傳基因的結(jié)構(gòu)和功能。通過改變微生物遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)就能影響其生物合成產(chǎn)物，包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、合成能力，以及產(chǎn)物的活性等［5］。而后通過一定的手段，從眾多的變異菌株中篩選出產(chǎn)量高，性狀優(yōu)良的突變株，進(jìn)一步研究測試其最佳生長溫度和培養(yǎng)基成分等。

本實驗通過60Co輻照誘變，成功獲得了幾株蛹蟲草誘變新菌株，與出發(fā)菌株相比，其胞外多糖產(chǎn)量提高很多。原因可能為經(jīng)過電離輻射后，出發(fā)菌株內(nèi)部遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，如DNA序列的改變，或者DNA上堿基對的變化等，其生物合成能力提高所致，這其中可能是編碼某個酶的序列的改變，或是合成多糖的編碼單位增加而使其活性增加。

本實驗所獲得的研究成果為以后的蛹蟲草新品種培育提供了有益的參考，也為蛹蟲草在食品藥品方面的應(yīng)用提供了可以借鑒的觀點(diǎn)，有益于改善蛹蟲草的產(chǎn)業(yè)前景。

［1］ Li SP，Yang FQ，Tsim KW. Quality control of Cordyceps sinensis， a valued traditional Chinese medicine［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2006， 41: 1571- 1584.

［2］ 王建芳， 楊春清. 蛹蟲草有效成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中藥研究進(jìn)展， 2005， 22（ 5） : 30-32.

［3］ Jong SL， Jeong SK， Dong PW， et a1. Study on macrophage activation and structural characteristics of purified polysaccharide from the liquid culture broth of Cordyceps millitaris［J］. Carbohydrate Polymers， 2010， 82: 982-988.

［4］ 田豐偉， 程傳榮， 袁維涵， 等. 原生質(zhì)體誘變選育ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌株［J］. 微生物學(xué)通報， 2010， 37（10）: 1457-1461.

［5］ 施巧琴， 吳松剛. 工業(yè)微生物育種學(xué)［M］. 北京：科學(xué)出版社， 2009.

S646

A

2095-0934（2015）06-371-03

嘉興市南湖區(qū)項目（2014QN06）；浙江省食用菌育種專項（2012C12911）

呂國英，博士，浙江省農(nóng)科院副研究員，主要從事食藥用菌研究工作，E-mail：bdzlgy@sohu.com