史　娟，李　江，葛紅光

（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000）

秦巴杜仲雄花總黃酮的提取及抗氧化穩(wěn)定性研究

史娟，李江，葛紅光

（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000）

以秦巴杜仲雄花為原料，采用微波預(yù)處理-乙醇回流法，在不同的乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和料液比下，探討秦巴杜仲雄花總黃酮的提取工藝。通過(guò)清除DPPH自由基法測(cè)定總黃酮的抗氧化活性，并研究不同條件下總黃酮抗氧化穩(wěn)定性。結(jié)果表明，乙醇濃度為60%，溫度為80℃，時(shí)間為2.5 h，料液比為1∶60時(shí)，杜仲雄花總黃酮得率最高，達(dá)到2.983%。溫度和金屬離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+對(duì)杜仲雄花總黃酮清除DPPH自由基的能力影響不大；金屬離子Cu2+、Zn2+以及pH、光照對(duì)抗氧化能力影響較大。

杜仲雄花，總黃酮，提取，抗氧化，穩(wěn)定性

秦巴山區(qū)是中國(guó)自然環(huán)境的十字交叉帶，兼有東西南北復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境特點(diǎn)，藥用植物資源豐富。杜仲是杜仲科（Eucommiaceae）、杜仲屬，多年生落葉喬木，在陜南秦巴山區(qū)資源豐富。因其產(chǎn)量大、質(zhì)量佳、藥效高，居全國(guó)四大名杜仲之首，被譽(yù)為“秦巴杜仲”。杜仲在中藥古典《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》中就被列為藥之上品，是中國(guó)特有的珍貴木本藥用植物，傳統(tǒng)以皮入藥［1］。目前，對(duì)于杜仲的研究主要集中在杜仲皮、杜仲葉中黃酮等有效成分的提取及含量測(cè)定［2-4］?，F(xiàn)代研究表明：杜仲黃酮具有抗自由基、抗氧化、抑菌、降脂減肥、抗病毒等作用［5］。

杜仲為雌雄異株植物，雄株占40%～60%。杜仲在我國(guó)栽種面積約36×104hm2，花量大，據(jù)估計(jì)每年有30 kt的產(chǎn)花量，資源豐富［6］。研究證明，杜仲雄花的黃酮類(lèi)化合物含量高于杜仲皮和葉，并富含綠原酸、礦質(zhì)元素和多種氨基酸，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及醫(yī)療保健作用［7］。目前，有關(guān)杜仲雄花中黃酮有效成分的提取、抗氧化活性研究較少［8-10］，研究外界因素對(duì)其抗氧化穩(wěn)定性影響的報(bào)道尚未見(jiàn)到。為此，本文對(duì)秦巴杜仲雄花總黃酮進(jìn)行提取、并對(duì)其抗氧化穩(wěn)定性進(jìn)行分析，以期為杜仲雄花可能作為抗氧化劑來(lái)源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

杜仲雄花采于漢中市陜西理工學(xué)院院內(nèi)；蘆丁對(duì)照品中國(guó)藥品生物制品檢定所；DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；無(wú)水乙醇、亞硫酸鈉、硝酸鋁、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化銅、氯化鋅等試劑均為分析純。

DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AL204-IC型電子分析天平梅特勒-托利多儀器上海有限公司；TDL-5臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；WP700型微波爐佛山市格蘭仕微波爐電器有限公司；RE-2A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；722-E型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精密儀器科學(xué)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取工藝流程新鮮杜仲雄花→烘干→研碎→微波預(yù)處理→乙醇回流→抽濾提取液→得黃酮提取物。

1.2.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱(chēng)取經(jīng)105℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品7.5 mg，加乙醇溶解并定容至50 mL，配成150 mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，移入10 mL刻度比色管中，分別加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻后放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液2 mL，用乙醇溶液定容至刻度，10 min后在510 nm處測(cè)定不同濃度蘆丁的吸光度，得到蘆丁濃度C（mg/mL）與吸光度A的回歸方程。

1.2.3杜仲雄花總黃酮提取及含量測(cè)定精確稱(chēng)取1.0 g干燥杜仲雄花粉末，置于250 mL圓底燒瓶中加入一定體積及濃度的乙醇溶液，在固定微波功率（500 W）下處理5 min后，在一定溫度下、回流一定時(shí)間后，抽濾并定容至50 mL容量瓶中，510 nm處測(cè)定提取液的吸光度，并計(jì)算其總黃酮得率。總黃酮得率（%）=總黃酮濃度×提取體積×稀釋倍數(shù)/杜仲雄花重量×100。

1.2.4杜仲雄花總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響杜仲雄花總黃酮提取中，固定微波預(yù)處理時(shí)間5 min，料液比1∶40，回流溫度60℃，提取時(shí)間2 h，改變乙醇濃度為30%、45%、60%、75%、90%，研究溶劑濃度對(duì)得率的影響。

1.2.4.2提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響以60%乙醇為溶劑，杜仲雄花微波預(yù)處理時(shí)間5 min后，固定料液比1∶40，提取時(shí)間2 h，改變提取溫度為50、60、70、80、90℃，考察溫度對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.4.3提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響杜仲雄花總黃酮提取中，以60%乙醇為溶劑，樣品微波預(yù)處理5 min后，固定料液比1∶40，提取溫度80℃，改變提取時(shí)間為1、1.5、2、2.5、3 h，考察時(shí)間對(duì)得率的影響。

1.2.4.4料液比對(duì)總黃酮得率的影響以60%乙醇為溶劑對(duì)杜仲雄花微波處理5 min后，設(shè)置提取溫度為80℃，浸提時(shí)間2 h，改變料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，研究料液比對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.5杜仲雄花總黃酮提取的正交實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和料液比為因素，設(shè)計(jì)L9（34）實(shí)驗(yàn)確定微波預(yù)處理-乙醇回流法的最佳提取工藝，因素水平見(jiàn)表1。

表1　L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels of L9（34）orthogonal experiments

1.2.6杜仲雄花總黃酮對(duì)DPPH自由基的活性測(cè)定采用清除DPPH自由基的能力，測(cè)定杜仲雄花總黃酮抗氧化活性［11］。測(cè)定時(shí)，在10 mL比色管中依次加入2.0 mL 2.0×10-4mol/L DPPH溶液和2.0 mL無(wú)水乙醇，混勻、靜置30 min后，用1 cm比色皿在510 nm波長(zhǎng)處，測(cè)吸光度值，記為A0；加入2.0 mL 2.0×10-4mol/L的DPPH溶液和2 mL杜仲雄花總黃酮試樣混勻后測(cè)定吸光度值，記為Ai。杜仲總黃酮試樣濃度設(shè)置6個(gè)梯度，每一吸光度平行測(cè)定3次，取其平均值，按下公式計(jì)算清除率：清除率（%）＝［（A0－Ai）/A0］×100。

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，以清除率為縱坐標(biāo)作圖，得到杜仲雄花總黃酮濃度與自由基清除率的關(guān)系。

1.2.7杜仲雄花總黃酮抗氧化穩(wěn)定性

1.2.7.1溫度對(duì)杜仲雄花總黃酮抗氧化穩(wěn)定性的影響取5 mL質(zhì)量濃度為380 μg/mL的杜仲雄花總黃酮溶液（據(jù)1.2.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇）置于有蓋試管中，分別于40、50、60、70、80、90、100℃的恒溫水浴中加熱1、3、6 h，以不做溫度處理的總黃酮溶液為對(duì)照，測(cè)定其對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.2.7.2光照對(duì)杜仲雄花總黃酮抗氧化穩(wěn)定性的影響取5 mL質(zhì)量濃度為380 μg/mL的杜仲雄花總黃酮溶液置于燒杯，在日光燈箱內(nèi)連續(xù)照射，并以未光照樣品作對(duì)照，每隔3 d測(cè)定1次其對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.2.7.3pH對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響取5 mL質(zhì)量濃度為380 μg/mL的杜仲雄花總黃酮溶液6份，分別置于6個(gè)小燒杯中，用稀鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)整pH為2、6、7、8、10、12。室溫下放置2 h后，取樣測(cè)定其對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.2.7.4金屬離子對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響取5 mL質(zhì)量濃度為380 μg/mL的杜仲雄花總黃酮溶液，分別添加濃度為50、100、150、200、250、300、350 mg/L的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+溶液，室溫下放置2 h后，取樣測(cè)定其對(duì)DPPH自由基的清除率，以不加金屬離子的提取液作為對(duì)照。

1.3數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)，取平均值，數(shù)據(jù)分析采用Origin8.0軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，得到回歸方程式：A=17.519C-0.011，R2=0.9993，表明蘆丁濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系，可將其應(yīng)用于總黃酮得率的測(cè)定中。

2.2杜仲雄花總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1最佳乙醇濃度的選擇通過(guò)改變乙醇濃度，研究其對(duì)總黃酮得率的影響。如圖1所示，在乙醇濃度為30%～60%內(nèi)，隨著乙醇濃度的增大，杜仲雄花總黃酮的得率逐漸增加，這是因?yàn)辄S酮類(lèi)化合物較易溶于乙醇，乙醇含量越大，杜仲雄花中黃酮化合物的析出就越多。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，得率最大。但當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其他脂溶性物質(zhì)雜質(zhì)同時(shí)溶出，干擾黃酮類(lèi)化合物的測(cè)定［12］。故提取杜仲雄花總黃酮時(shí)，選擇最佳乙醇濃度為60%。

圖1　乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on the yield of total flavone

2.2.2最佳提取溫度的選擇在圖2中，隨著溫度升高，杜仲雄花總黃酮得率呈增加趨勢(shì)，因?yàn)殡S溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，溶質(zhì)分子與溶劑分子能夠充分接觸，黃酮類(lèi)化合物更易從細(xì)胞中轉(zhuǎn)移至溶劑［11-12］。當(dāng)溫度高于70℃時(shí)，杜仲雄花總黃酮得率下降；因?yàn)檫^(guò)高的提取溫度，可能導(dǎo)致活性成分結(jié)構(gòu)遭到破壞，且雜質(zhì)溶出量也相應(yīng)增大。所以，選擇最佳提取溫度為70℃。

圖2　提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2　Effect of extraction temperature on the yield of total flavone

2.2.3最佳提取時(shí)間的選擇圖3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在一定范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，杜仲雄花總黃酮的得率隨之上升，在2.0 h時(shí)達(dá)到最大值。主要原因是時(shí)間過(guò)短，黃酮類(lèi)化合物還未充分溶出，時(shí)間在2.0 h時(shí)黃酮類(lèi)化合物溶出已達(dá)到平衡；再延長(zhǎng)時(shí)間，一些熱敏性組分被破壞，或者溶劑揮發(fā)導(dǎo)致乙醇濃度降低，而使黃酮類(lèi)化合物得率降低。所以2.0 h為提取較適宜時(shí)間。

2.2.4料液比對(duì)總黃酮得率的影響如圖4所示，隨著料液比的增大，杜仲雄花總黃酮的得率逐漸增大，在1∶50時(shí)得率最大；再增加料液比，總黃酮得率下降。因此，在保證提取效果的同時(shí)，應(yīng)盡量減少溶劑的用量，降低減壓濃縮消耗的能量。選擇料液比1∶50為適宜條件。

圖3　提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3　Effect of extraction time on the yield of total flavone

圖4　料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4　Effect of material/liquid ratio on the yield of total flavone

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Orthogonal test design and results

2.3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表2可知，各因素對(duì)杜仲雄花總黃酮得率的影響大小是A＞B＞D＞C，即乙醇濃度影響最大，提取溫度影響其次，時(shí)間影響最小。杜仲雄花有效成分的最佳提取工藝是A2B3C3D3，即乙醇濃度為60%，提取溫度為80℃，時(shí)間為2.5 h，料液比為1∶60。表3方差分析結(jié)果顯示，乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響最大，為顯著性因素。

2.3.2驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，按上述最佳條件：乙醇濃度為60%，提取溫度為80℃，時(shí)間為2.5 h，料液比為1∶60，進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。用紫外分光光度法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算出杜仲雄花總黃酮的得率，得到的平均得率為2.983%。

2.4杜仲雄花總黃酮清除DPPH自由基能力

采用清除DPPH自由基的能力，測(cè)定杜仲雄花總黃酮抗氧化活性，結(jié)果如圖5所示。在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，杜仲黃酮清除自由基的能力與樣品濃度具有較好濃度-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。擬合方程為Y=0.00922X+ 2.512（R2=0.9906）。

表3　正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3　Analysis of variance

圖5　杜仲雄花總黃酮對(duì)DPPH自由基清除的能力（n=3）Fig.5　Scavenging ability of total flavone from male flowers of Eucommia ulmoides（n=3）

2.5杜仲雄花總黃酮抗氧化穩(wěn)定性

2.5.1溫度對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響與室溫未做加熱處理杜仲黃酮清除率相比（清除率保持在82.1%～83.4%），圖6的40～100℃范圍內(nèi)，杜仲雄花總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用隨著溫度的升高，緩慢下降。且下降幅度同時(shí)還受熱處理時(shí)間的影響：時(shí)間越長(zhǎng)，抗氧化穩(wěn)定性下降越大。但總體而言，杜仲雄花總黃酮在高溫下仍可表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性，溫度對(duì)抗氧化能力的影響不明顯。

2.5.2光照對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響在圖7中，杜仲雄花總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，不斷減弱；直至光照8 d后下降至54.1%，此后趨于平緩。光照實(shí)驗(yàn)前后，清除率下降達(dá)28.3%；而未光照樣品的對(duì)照組，清除率下降僅有5.2%。說(shuō)明杜仲雄花總黃酮在光照條件下不穩(wěn)定。主要是因?yàn)辄S酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)中多含有酚羥基，光照下易被氧化為醌類(lèi)物質(zhì)，從而導(dǎo)致其抗氧化性減弱。

2.5.3pH對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響由圖8可知，杜仲雄花總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用在酸性條件下較穩(wěn)定，抗氧化能力較強(qiáng)。當(dāng)pH大于7時(shí)，清除率迅速下降，至pH為12時(shí)，清除率僅為39.7%。這主要受到黃酮類(lèi)化合物自身結(jié)構(gòu)的影響，在堿性條件下，結(jié)構(gòu)中所含酚羥基已被破壞，而導(dǎo)致抗氧化活性降低。

圖6　溫度對(duì)杜仲雄花總黃酮清除DPPH自由基的影響Fig.6　Effect of temperature on antioxidant stability of total flavone from male flowers of Eucommia ulmoides

圖7　光照對(duì)杜仲雄花總黃酮清除DPPH自由基的影響Fig.7　Effect of illumination on antioxidant stability of total flavone from male flowers of Eucommia ulmoides

圖8　pH對(duì)杜仲雄花總黃酮清除DPPH自由基的影響Fig.8　Effect of pH on antioxidant stability of total flavone from male flowers of Eucommia ulmoides

2.5.4金屬離子對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響在表9所示的實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，Na+、K+、Mg2+、Ca2+對(duì)杜仲雄花總黃酮清除DPPH自由基活性影響較?。欢鳽n2+、Cu2+影響較大，且隨著金屬離子濃度的增加，抗氧化活性呈下降趨勢(shì)。分析原因，可能與黃酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)中所含酚羥基或羰基，可與某些金屬離子進(jìn)行絡(luò)合致使其性質(zhì)發(fā)生改變，從而降低了抗氧化活性。

圖9　金屬離子對(duì)杜仲雄花總黃酮清除DPPH自由基的影響Fig.9　Effect of metal ions on antioxidant stability of flavone from male flowers of Eucommia ulmoides

3　結(jié)論

通過(guò)微波預(yù)處理-乙醇回流法對(duì)杜仲雄花黃酮進(jìn)行了提取，得到最佳提取工藝是乙醇濃度60%，提取溫度80℃，時(shí)間為2.5 h，料液比1∶60，該條件下杜仲雄花總黃酮得率為2.983%。溫度及Na+、K+、Ca2+、Mg2+四種金屬離子對(duì)總黃酮清除DPPH自由基的能力影響不大；而金屬離子Cu2+、Zn2+以及pH、光照對(duì)抗氧化能力影響較大。因此，在對(duì)杜仲雄花總黃酮的制備和使用過(guò)程中，應(yīng)避免強(qiáng)堿或強(qiáng)光條件下保存；同時(shí)要注意避免與一些高濃度金屬離子Cu2+、Zn2+的接觸。

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Extraction of flavone from male flowers of Qinba Eucommia ulmoides and their antioxidant stability

SHI Juan，LI Jiang，GE Hong-guang
（School of Chemistry and Environment Science，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China）

The extraction process of flavone in male flowers of Qinba Eucommia ulmoides assisted by microwave pretreatment was studied.The flavone extraction from the different ethanol concentration，extraction time，extraction temperature and solid-to-liquid ratio were studied.And the antioxidant stability of total flavonoe was assessed by its capacity to scavenge the DPPH free radical under different treatments.The results showed that the best extraction process condition was：ethanol concentration 60%，abstracting temperature 80℃，abstracting time 2.5 h and the ratio of solid to extracting liquid 1∶60（g/mL）.The total flavone extraction yield could reach 2.983%in the optimum conditions.The temperature and metal ions（Na+，K+，Ca2+，Mg2+）did not produce a great reduction of scavenging capacity.While the Zn2+，Cu2+，pH and illumination had a bigger influence to the antioxidation stability of flavone in male flowers of Qinba Eucommia ulmoides.

male flowers of Eucommia ulmoides；total flavone；extraction；antioxidant；stability

TS201.1

B

1002-0306（2015）16-0252-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.043

2014-12-08

史娟（1978-），女，在讀博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)和有機(jī)合成，E-mail：hzhshijuan@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金（21373132）；教育廳2012年科學(xué)研究項(xiàng)目（12JK0633）。