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大鼠冷藏保存供肝時間對肝移植后炎癥因子的影響

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目的是考察大鼠冷藏保存供肝時間對肝移植后炎癥因子的影響。方法是將大鼠隨機(jī)分為2組，3小時保存組和6小時保存組，觀察不同冷藏保存時間對大鼠肝移植后的炎癥因子水平。結(jié)果是兩個組別移植后30分鐘的NF～α和IL～8均明顯增高（P＜0.05），與3小時保存組相比，6小時保存組移植后10～30分鐘的NF～α和IL～8水平較低（P＜0.05），3小時保存組的生存中位數(shù)為93.1小時（42.1小時～5天），6小時保存組的生存中位數(shù)為32.5小時（1.0～49.4小時），與3小時保存組相比，6小時保存組大鼠的生存時間明顯縮短（P＜0.05）。結(jié)論：冷凍保存供肝時間越長，炎癥因子水平越高，提示冷凍供肝后應(yīng)及時進(jìn)行肝移植。

肝移植；冷藏保存；炎癥因子

冷凍保存供肝是肝移植臨床采用的主要保存方法，但手術(shù)對保存時間有較大爭議，因此考察冷凍保存供肝對于肝移植具有重要意義［1～3］。本課題以大鼠為研究對象，考察冷凍保存時間對肝移植的炎性反應(yīng)及對大鼠生存時間的影響。

1　材料和方法

（1）實驗動物。SPF級雄性大鼠50只，180～220g，清潔環(huán)境飼養(yǎng)，根據(jù)供體肝在體外低溫保存時間隨機(jī)分為2個組別：3小時保存組和6小時保存組。

（2）實驗步驟。所有動物術(shù)前過夜禁食，不禁水，在無菌操作臺下，乙醚吸入麻醉，腹部橫切，游離肝周圍韌帶，結(jié)扎左隔靜脈、右腎上腺靜脈叢、右腎靜脈幽門靜脈與肝動脈。將支架插入膽總管，手術(shù)線固定，肝下下腔靜脈注入肝素平衡液1.0mL和0℃的UW液3mL，從肝門靜脈灌洗肝臟，剪斷肝上下腔靜脈，游離肝并切除左葉和尾葉，將肝置于0℃的UW液，修剪肝下下腔靜脈，安置門靜脈與肝下下腔靜脈袖套5～0線固定。再將供肝保存在50mL0～4℃UW液，受體肝切除，在供肝門靜脈注入15mL乳酸鈉平衡液，排出供肝內(nèi)UW液，肝上下腔靜脈置8～0無損傷縫線結(jié)扎受體肝下下腔和門靜脈，從門靜脈入肝方向注入0.9％氯化鈉注射液3mL，血管夾阻斷肝上下腔靜脈，切去肝臟，放入供肝，采用袖套法吻合門靜脈和肝下下腔，松開血管鉗，大鼠的空肝期10分鐘，移植術(shù)后尾靜脈注射青霉素，保溫毯飼養(yǎng)。

（3）觀察指標(biāo)。檢測移植后30分鐘內(nèi)大鼠外周血的腫瘤壞死因子～（TNF～）和白細(xì)胞介素～8（IL～8）水平，并進(jìn)行組間和組內(nèi)比較。

（4）統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)輸入SPSS18.0軟件統(tǒng)計報，計量資料采用x±s表示，并用方差分析，P＜0.05差異有顯著性意義。

2　結(jié)果

（1）兩個組別移植后的炎癥因子比較。兩個組別移植后30分鐘的NF～α和IL～8均明顯增高（P＜0.05），與3小時保存組比，6小時保存組移植后10～30分鐘的NF～α和IL～8水平較低（P＜0.05）?？蓞⒁姳?。

表1　兩個組別移植后炎癥因子比較（pg/mg）

（2）兩個組別的生存中位數(shù)比較。3小時保存組的生存中位數(shù)為93.1小時（42.1小時～5天），6小時保存組的生存中位數(shù)為32.5小時（1.0～49.4小時），與3小時保存組比，6小時保存組大鼠的生存時間明顯縮短（P＜0.05）。

3　討論

肝臟是移植免疫較為特殊的器官，與其他器官移植比，肝移植排斥的發(fā)生率最低，原因在于肝臟的免疫耐受，但缺血再灌注損傷是造成移植失敗的主要原因，缺血再灌注期時的氧自由基可激活核轉(zhuǎn)錄因子，激活的核轉(zhuǎn)錄因子可促進(jìn)TNF～α和IL～8等炎癥因子大量增加，引起肝組織中損傷，損傷的肝又可產(chǎn)生自由基，上述炎癥因子水平增高而加重炎癥，導(dǎo)致肝損害，進(jìn)而影響肝移植效果。

研究顯示，再灌注損傷會隨著冷保存時間的延長而加重，本課題結(jié)果顯示，短時間（3小時）保存再移植后，30分鐘內(nèi)的炎癥因子TNF～α和IL～8水平與長時間（6小時）組相比明顯降低，但兩個組別移植后30分鐘內(nèi)均存在炎癥因子水平增高的過程，也提示了再灌注的炎性反應(yīng)。另外一方面，大鼠的生存時間也與冷凍保存時間相關(guān)，保存時間短的組別生存時間也明顯延長，本課題結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果相似，Miyagawa等人研究顯示，體外低溫保存16小時的存活率是體外保存24小時的7倍，Yu等人研究，體外低溫保存8小時大鼠的存活率是9小時組的2倍以上，可見，體外保存時間對肝移植的效果影響較大，建議為了提高肝移植成功率，供體肝應(yīng)盡早進(jìn)行移植術(shù)。

本課題的不足為，大鼠的肝移植后生存時間較短，一定程度影響了系統(tǒng)評估冷凍保存供肝對肝移植效果，因此有必要選擇耐受性較好的犬或豬進(jìn)行，增加炎癥因子或免疫蛋白表達(dá)的檢測，進(jìn)一步分析和推算冷凍保存的時間窗。

［1］胡振華.肝切除與補(bǔ)救性肝移植治療肝細(xì)胞肝癌的研究與進(jìn)展［D］.浙江大學(xué)，2012.

［2］譚凱.成人首次肝移植術(shù)后早期死亡的相關(guān)因素分析［D］.南方醫(yī)科大學(xué)，2012.

［3］熊日暉.不同熱缺血時間對大鼠心臟死亡中度脂肪肝肝移植影響的實驗研究［D］.福建醫(yī)科大學(xué)，2014.

［4］冉江華，李鑄，劉靜，等.二袖套法建立恒河猴原位肝移植的穩(wěn)定模型［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（05）：762～768.［5］葉明.肝移植受體預(yù)后多因素分析臨床研究［D］.浙江大學(xué)，2004.

［6］陳瀅.再次肝移植患者術(shù)后生存率及預(yù)后影響因素分析［D］.浙江大學(xué)，2013.

［7］易慧敏，安玉玲，張彤，等.內(nèi)毒素血癥及炎癥因子在肝肺綜合征中的作用及其在肝移植術(shù)后的變化［J］.器官移植，2013，4（06）：350～353+376.