趙群濤 楊俊杰 方永凱 盚罡 李丹
(1信陽市食品藥品檢驗所,河南信陽464000;2信陽農(nóng)林學(xué)院生物技術(shù)系)
H PLC-U V測定歸脾丸(濃縮丸)中酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量
趙群濤1楊俊杰2方永凱1盚罡1李丹1
(1信陽市食品藥品檢驗所,河南信陽464000;2信陽農(nóng)林學(xué)院生物技術(shù)系)
目的:建立高效液相色譜紫外檢測法(HPLC-UV)同時測定歸脾丸(濃縮丸)中酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷含量的方法。方法:色譜柱為Thermo Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈-水為流動相(28∶72),檢測波長204 nm;流速1.0 mL/min;柱溫28℃。結(jié)果:酸棗仁皂苷A進樣量在2.53~15.18 μg,黃芪甲苷進樣量在2.55~15.30 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,回收率分別為99.1%和98.4%。結(jié)論:該方法靈敏、重復(fù)性好,可用于歸脾丸(濃縮丸)的質(zhì)量控制。
歸脾丸(濃縮丸);酸棗仁皂苷A;黃芪甲苷;高效液相色譜紫外檢測法
歸脾丸(濃縮丸)由黨參、白術(shù)、黃芪、當(dāng)歸、遠志、酸棗仁、甘草等13味中藥組成,現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第七冊》,有益氣健脾、養(yǎng)血安神的功效,用于心脾兩虛,失眠多夢,頭昏頭暈,崩漏便血等癥。該制劑中黃芪和酸棗仁分別是補氣和安神的代表性藥物,其主要有效成分分別是黃芪甲苷和酸棗仁皂苷A。本研究在前期實驗基礎(chǔ)上考察高效液相色譜紫外檢測法(HPLCUV)測定歸脾丸(濃縮丸)中這兩種成分含量的可行性。
Agilent 1260高效液相色譜儀(DAD檢測器),Waters高效液相色譜儀(2489紫外檢測器串聯(lián)2420蒸發(fā)光檢測器,高效液相色譜-紫外檢測器聯(lián)用蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-UV-ELSD));METTLER TOLEDO XS205電子天平,基因型1850摩爾超純水機(重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司)。酸棗仁皂苷A(110734-200407)和黃芪甲苷(110781-201314)均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈購自TEDIA Company.INC公司,均為色譜純,水為Ⅰ級超純水,其他試劑均為分析純。歸脾丸(濃縮丸)均為市售,見表1。
表1 樣品含量測定結(jié)果 (mg/g)
2.1色譜條件
Agilent 1260色譜儀,Thermo Hypersil BDS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);乙腈-水(28∶72)作流動相,檢測波長204 nm,流速1.0 mL/min;柱溫28℃;進樣量10 μL。
2.2試液的制備
2.2.1混合對照品溶液精密稱取兩種對照品適量,加甲醇制成含酸棗仁皂苷A 0.506 mg/mL、黃芪甲苷0.51 mg/mL的混合對照品溶液。
2.2.2供試品溶液將本品研碎,取約8.0 g,精密稱定,置索氏提取器中,加甲醇適量回流提取6 h,提取液水浴蒸干,殘渣用水25 mL微熱使溶解,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,用石油醚(60~90℃)洗滌3次,每次25 mL,水液用水飽和的正丁醇提取3次,每次25 mL,再用正丁醇飽和的0.5%氫氧化鈉溶液洗滌3次,每次25 mL,蒸干正丁醇提取液,殘渣加甲醇轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,用0.45 μm濾膜過濾測定。
2.2.3陰性樣品溶液根據(jù)歸脾丸(濃縮丸)的處方,制備不含黃芪和酸棗仁的陰性樣品,按上述方法制成陰性樣品溶液。
2.3專屬性試驗
分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液,按“2.1”色譜條件測定,結(jié)果陰性無干擾,見圖1。
圖1 HPLC-UV色譜圖
2.4檢測限和定量限
將各對照品色譜峰測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較,分別以信噪比為3∶1及10∶1時注入儀器的量確定檢測限和定量限,結(jié)果見表1。
2.5線性關(guān)系考察
精密吸取混合對照品儲備溶液5,10,15,20,30 μL,按“2.1”色譜條件進行測定,分析結(jié)果以峰面積Y對對照品的進樣量X(μg)進行回歸,得回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍,結(jié)果見表2。
2.6精密度試驗
精密吸取樣品溶液連續(xù)進樣6次,計算峰面積積分值,酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的RSD分別為0.8%和1.0%,表明儀器精密度良好。
2.7穩(wěn)定性試驗
取同一份供試品溶液,分別于0,1,3,6,9,12,24 h測定,記錄峰面積,酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的RSD分別為1.1%和1.3%,結(jié)果顯示樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.8重復(fù)性試驗
取同一批(140309)樣品按“2.2”項方法平行制備6份,按“2.1”色譜條件測定酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量,計算RSD。測得酸棗仁皂苷A的含量分別為0.293,0.290,0.299,0.296,0.297,0.291 mg/g,RSD為1.2%;黃芪甲苷的含量分別為0.210,0.213,0.217,0.216,0.219,0.215 mg/g,RSD為1.5%,結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。
2.9加樣回收率試驗
精密稱取兩種對照品適量制成含酸棗仁皂苷A 1.15 mg/mL、黃芪甲苷0.85 mg/mL的混合對照品溶液。取同一批(140309)樣品6份,每份約8.0 g,精密稱定,精密加入上述混合對照品溶液2 mL,按“2.2.2”項方法制備,再按“2.1”色譜條件測定酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量并計算回收率。結(jié)果見表3。
2.10樣品測定
按照“2.2.2”方法制備5個批號樣品,按“2.1”色譜法測定酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量,結(jié)果見表1。
表2 對照品線性關(guān)系考察
表3 加樣回收率測定結(jié)果(n=6)
3.1用DAD檢測器在190~400 nm掃描對照品溶液,發(fā)現(xiàn)酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷均僅有末端吸收。在Waters色譜儀上用HPLC-UV-ELSD法測定5個廠家的樣品,當(dāng)不用石油醚洗滌甲醇提取液[1]時,紫外檢測器檢測的樣品峰太多,兩種待檢測成分峰響應(yīng)比較低,且不容易與前后峰分開,批分析100 min時上一針未出完峰仍會淹沒下一針樣品的這兩種成分峰,導(dǎo)致下針無待分析成分峰,在Agilent 1260色譜儀DAD檢測器上也是這種情況,說明不能用HPLC-UV法分析;而在蒸發(fā)光檢測器下樣品峰較少,兩種待測成分峰較高并與鄰近峰分離良好,可以滿足分析要求。樣品用石油醚洗滌除雜,在兩臺儀器上經(jīng)方法學(xué)考察,HPLC-UV法可以滿足測定要求。
3.2樣品處理比較了甲醇常溫超聲30 min、回流4 h和索氏提取6 h[2-3],結(jié)果超聲和回流不同時間提取液的酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷含量相差不大,均低于索氏提取的含量。經(jīng)試驗石油醚索氏提取5 h脫脂[4]后再用甲醇索氏提取或甲醇索氏提取后用石油醚萃?。?],兩種提取方法測得的兩種待測成分的含量沒有明顯差別,但甲醇提取液蒸干后油脂較大,后者更利于下一步正丁醇的提取且萃取較索氏提取用時更少。測試結(jié)果表明用正丁醇飽和的0.5%氫氧化鈉溶液洗滌正丁醇提取液,比用氨試液[6]和1%氫氧化鈉溶液洗滌[3]的兩種待測成分的含量高。甲醇索氏提取液蒸干后用水轉(zhuǎn)移直接過D101大孔樹脂柱處理[1,3],樣品溶液因油脂太大極難過濾;用本文方法處理5個廠家的樣品溶液再經(jīng)D101大孔樹脂柱處理[3],有的樣品待測成分會比本文的方法略高,但不顯著,有的含量反而沒有本文的方法高,說明增加提取步驟會加大誤差,經(jīng)考察本文的方法已能滿足分析要求,不同提取方法測定結(jié)果見表4。
表4 不同提取方法樣品含量測定結(jié)果(mg/g)
3.3歸脾丸(濃縮丸)原標準沒有含量測定項,目前測定黃芪和酸棗仁藥材及其制劑中黃芪甲苷和酸棗仁皂苷A含量的文獻多是用HPLC-ELSD[1-4,6],還未見用HPLC-UV同時測定這兩種成分的文獻報道,經(jīng)考察用HPLC-UV也能滿足實驗分析要求且HPLC-UV應(yīng)用更廣泛。實驗過程中曾考慮同時測定補氣藥黃芪中黃芪甲苷、補血藥當(dāng)歸中阿魏酸、安神藥酸棗仁皂苷A和調(diào)和藥甘草中甘草酸含量,通過測定君臣佐使藥以全面控制歸脾丸(濃縮丸)質(zhì)量,為分析不同廠家的產(chǎn)品提供依據(jù)[7],但研究表明黃芪甲苷和酸棗仁皂苷A的正丁醇提取液不用氨試液等堿液洗滌,樣品干擾成分增多影響分離且導(dǎo)致待測成分含量降低,用堿液會破壞酸性成分阿魏酸和甘草酸,這4種成分不能用一種方法進行提取,同時由于HPLC-UV樣品峰較多,即使分別提取也不能用同一分析方法測定,最終無法實現(xiàn)4種成分的同時測定。
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Simultaneous Determination of Jujubosede A and AstragalosideⅣin Guipi Pills(Concentrated Pills)by HPLC-UV
Zhao Quntao1,Yang Junjie2,F(xiàn)ang Yongkai1,Qiu Gang1,Li Dan1
(1 Xinyang Institute for Food and Drug Control,Henan Xinyang 464000,China;2 Biotechnology Department of Xinyang Agriculture and Forestry College)
Objective:To establish a method for the simultaneous determination of the contents of jujuboside A and astragalosideⅣin guipi pills(concentrated pills)by HPLC-UV.Methods:HPLC-UV was performed on Thermo Hypersil BDS C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)with a mobile phase of acetonitrile-water(28∶72),detection wavelength was at 204 nm,the flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was at 28℃. Results:A good linear relationship was obtained within the range of 2.53~15.18 μg and 2.55~15.30 μg for jujuboside A and astragalosideⅣ,and the recovery rate was 99.1%and 98.4%respectively.Conclusion:The method was sensitive and reproducible and is suitable for the quality control of guipi pills(concentrated pills).
Guipi Pills(Concentrated Pills);Jujuboside A;AstragalosideⅣ;HPLC-UV
10.3969/j.issn.1672-5433.2015.09.008
2015-05-12)
河南省2013年科技發(fā)展計劃基金資助(132102310265)
趙群濤,男,主管中藥師。研究方向:中藥質(zhì)量分析。E-mail:28843515@qq.com