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玉米苗期室內(nèi)菌土接種絲黑穗病菌侵染條件的優(yōu)化

王振華，孫培元，李寧寧，邸宏，王禹賀，劉顯君，張林，于滔

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：研究以高感絲黑穗病玉米自交系黃早四為材料，模擬大田環(huán)境在室內(nèi)研究溫度、土壤濕度、菌土濃度等因素對(duì)玉米苗期絲黑穗病菌侵染效果的影響。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，借助PCR檢測(cè)技術(shù)分析9種不同條件下病菌侵染率，通過(guò)多重比較篩選出最優(yōu)侵染條件；在優(yōu)化的侵染條件下室內(nèi)接種已知不同抗性級(jí)別的20份玉米自交系，并移栽到田間驗(yàn)證侵染效果。結(jié)果表明，室內(nèi)接種絲黑穗病菌最佳侵染條件為土壤濕度20%，菌土濃度1%，20℃光照培養(yǎng)8 h和15℃暗培養(yǎng)16 h變溫培養(yǎng)；20份玉米自交系室內(nèi)接種后移入田間發(fā)病率均高于歷年田間直接接種發(fā)病率，兩者呈極顯著正相關(guān)。研究?jī)?yōu)化并驗(yàn)證玉米苗期絲黑穗病菌室內(nèi)侵染條件，可為研究該病室內(nèi)快速鑒定方法奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：玉米；絲黑穗病；室內(nèi)接種；侵染條件

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2015-1-12 9:53:17

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150112.0953.010.html

王振華,孫培元,李寧寧,等.玉米苗期室內(nèi)菌土接種絲黑穗病菌侵染條件的優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 46(1): 1-5.

玉米絲黑穗病菌病原菌為玉米絲軸黑粉菌（Sporisorium reilianum f. sp. zeae），擔(dān)子菌屬。該病是世界性的重要玉米病害[1]，最有效的防治方法是培育和利用抗病品種[2]，而抗絲黑穗病資源鑒定是培育抗病玉米新品種基礎(chǔ)。傳統(tǒng)資源評(píng)價(jià)方式為田間菌土接種法，該法存在鑒定周期長(zhǎng)、用地量多、鑒定群體大、受環(huán)境影響較大等缺點(diǎn)[3]，因此建立室內(nèi)接種技術(shù)尤為重要。檀國(guó)慶研究表明，人工室內(nèi)接種效果主要受培養(yǎng)溫度、土壤濕度和菌土濃度等多因素影響[4]。Kispatic等認(rèn)為病原菌最佳侵染溫度為24℃[5]，張志德則認(rèn)為22℃為玉米絲黑穗病菌最佳侵染溫度[6]，而吳新蘭等研究認(rèn)為最佳侵染溫度為25℃[7]；劉惕若等研究認(rèn)為25%土壤含水量條件下發(fā)病率最高[8]，張志德認(rèn)為15.5%時(shí)發(fā)病率最高[6]；菌土濃度對(duì)玉米絲黑穗病發(fā)病率的影響，研究者多認(rèn)為，菌含量增加發(fā)病率隨之提高，到達(dá)一定濃度后，菌土濃度升高而發(fā)病率保持平衡[4,9-10]。上述報(bào)道均以單個(gè)影響因素為研究對(duì)象，而關(guān)于絲黑穗病菌侵染條件的多因素分析卻鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以高感（HS）玉米自交系黃早四為材料，通過(guò)室內(nèi)模擬田間環(huán)境，采用PCR技術(shù)檢測(cè)侵染率與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法，優(yōu)化玉米絲黑穗病菌室內(nèi)最佳侵染條件。同時(shí)以20份已知發(fā)病率不同的玉米自交系為材料，采用優(yōu)化的最佳侵染條件接種后移入大田調(diào)查發(fā)病率，驗(yàn)證接種條件正確性，為探究室內(nèi)快速鑒定方法提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所用高感絲黑穗病玉米自交系黃早四和20份不同抗性級(jí)別玉米自交系由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所提供，自交系田間發(fā)病率及抗病等級(jí)數(shù)據(jù)來(lái)源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)王振華教授、甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所郭滿庫(kù)、吉林大學(xué)高樹(shù)仁等[11-13]及東北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所歷年田間鑒定數(shù)據(jù)。試驗(yàn)用菌為2012年秋季在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地（哈爾濱）從典型病株上采集病癭，風(fēng)干后裝布袋內(nèi)通風(fēng)處越冬，使用前將病癭上的菌粉抖落，用40目銅篩篩出冬孢子。試驗(yàn)用黑鈣土來(lái)自于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地（哈爾濱）10年內(nèi)未種植玉米的地塊，土壤經(jīng)2 mm×2 mm篩子篩出后，105℃烘箱內(nèi)滅菌4~6 h備用。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以玉米自交系黃早四為材料，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1），對(duì)影響玉米絲黑穗病發(fā)病的主要條件土壤濕度、菌土濃度和培養(yǎng)溫度3個(gè)條件的3個(gè)不同水平進(jìn)行研究，其中高溫時(shí)光照8 h，低溫時(shí)暗培養(yǎng)16 h，試驗(yàn)共9個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置4次重復(fù)，每次重復(fù)100粒種子。

表1　L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1　L9(34) orthogonal design

1.3室內(nèi)接種

選取籽粒飽滿、大小一致玉米自交系種子，蒸餾水清洗3次后，用濃度為1%次氯酸鈉消毒20 min，蒸餾水清洗5次。在發(fā)芽盒（長(zhǎng)?寬?高=18 cm? 14 cm?12 cm）內(nèi)放入600 g高溫滅菌土，加水配置成絕對(duì)含水量為15%、17%和20%的濕土，種胚朝下將消毒后種子擺在土壤上，每盒播種50粒；用0.5%、1%和3%菌土覆蓋在種子上，每粒種子覆蓋2 g，厚度約1 cm；再用200 g上述絕對(duì)含水量的濕菌土覆蓋，攤平不要壓實(shí)，蓋上蓋子保濕。發(fā)芽盒在人工氣候箱中培養(yǎng)，三種不同培養(yǎng)條件見(jiàn)表1。待幼苗長(zhǎng)至3葉期時(shí)開(kāi)蓋，每盒加入50 mL水，20℃持續(xù)光照恒溫培養(yǎng)，防止開(kāi)蓋后水分大量蒸發(fā)導(dǎo)致苗干旱死亡。

1.4 PCR檢測(cè)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，待每株玉米幼苗長(zhǎng)到三葉期時(shí)取第3葉葉鞘，用含70%酒精棉擦拭表面，并用含滅菌水的棉花擦拭清除殘留酒精，用CTAB小量法提取全部幼苗第3葉葉鞘總DNA。由上海生工合成Xu等所設(shè)計(jì)的SSR引物SR3[7]，序列為5' GCAGCCTCAGCATTACTC 3'，5' ATACAC CTGTGACGGCTG 3'，PCR反應(yīng)總體積為30 μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃3 min；94℃30 s，56℃40 s，72℃1 min，循環(huán)37次；最后72℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

侵染率（%）＝PCR檢測(cè)陽(yáng)性株數(shù)/檢測(cè)總株數(shù)× 100%。

1.5最優(yōu)室內(nèi)侵染條件驗(yàn)證

將20份玉米自交系在優(yōu)化后的玉米絲黑穗病室內(nèi)最佳侵染及培養(yǎng)條件下接菌種植，當(dāng)幼苗至3葉期時(shí)，將其移栽到哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地。設(shè)置接菌處理與不接菌對(duì)照兩組處理，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)自交系種植3次重復(fù)，處理與對(duì)照組同為雙行區(qū)，每行21株，株距25 cm，行距70 cm，行長(zhǎng)5 m。正常田間管理，至乳熟末期，調(diào)查其絲黑穗病發(fā)病率。

發(fā)病率（%）＝（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%

與其歷年平均發(fā)病率進(jìn)行回歸分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢測(cè)。數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析采用SAS 9.1.3軟件和Excel 2010。

2　結(jié)果與分析

2.1 PCR技術(shù)檢測(cè)玉米自交系黃早四苗期絲黑穗病菌侵染率

以SSR引物SR3對(duì)玉米自交系黃早四人工接種后三葉期時(shí)第3葉葉鞘DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，部分樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

其中，陽(yáng)性對(duì)照和病原菌侵染的樣品能夠擴(kuò)增出680 bp特異條帶，陰性對(duì)照和水對(duì)照未擴(kuò)增出特異條帶，說(shuō)明可以用PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率作為病原菌侵染率。

圖1　玉米絲黑穗病菌侵染率的PCR檢測(cè)Fig. 1　PCR result of infection rate of maize head smut

2.2在不同接種培養(yǎng)條件下的病原菌侵染率差異分析

對(duì)正交試驗(yàn)9個(gè)處理4次重復(fù)病原菌對(duì)玉米自交系黃早四侵染率的結(jié)果進(jìn)行鄧肯氏多重比較，結(jié)果見(jiàn)表2。9個(gè)處理中處理8和處理1與其他處理差異極顯著，其中病原菌侵染率最高的為處理8，即土壤濕度20%、菌土濃度1%、培養(yǎng)溫度20℃/15℃變溫，其次為處理1；病原菌侵染率最低的為處理4，即土壤濕度17%、菌土濃度0.5%、培養(yǎng)溫度25℃/15℃變溫條件，侵染率為42.00%。

試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)土壤濕度影響幼苗死亡率，土壤濕度為15%時(shí)幼苗死亡率達(dá)到14.42%，遠(yuǎn)高于土壤濕度為17%（死亡率6.92%）和20%（死亡率3.33%）。處理8土壤濕度為20%，在9個(gè)處理中平均侵染率最高，同時(shí)苗穩(wěn)定性最優(yōu)，死亡率也最低。因此本研究確定室內(nèi)最優(yōu)的玉米絲黑穗病菌侵染條件為處理8。

表2　不同侵染條件下病原菌侵染率的多重比較Table 2　Multiple comparison results of infection rateunder different treatments

2.3玉米絲黑穗病菌室內(nèi)接種最優(yōu)侵染條件的田間驗(yàn)證

本研究對(duì)20份不同抗性玉米自交系在上述篩選出的室內(nèi)最優(yōu)病原菌侵染條件下接種，3葉期移栽至田間，乳熟期調(diào)查發(fā)病率，結(jié)果見(jiàn)表3。20份自交系人工室內(nèi)接種后田間平均發(fā)病率為38.09%，其中發(fā)病率最高的玉米自交系為京七，發(fā)病率為94.83%，發(fā)病率最低的為齊319，發(fā)病率為2.46%。4份高抗玉米自交系人工接種后田間平均發(fā)病率為3.87%?發(fā)病率最高的為丹9046 （6.12%）?發(fā)病率最低的為齊319（2.46%）；4份抗病玉米自交系平均發(fā)病率為9.93%，發(fā)病率最高的為龍抗11（17.03%），發(fā)病率最低的為Mo17（3.76%）；4份中抗玉米自交系平均發(fā)病率為14.56%，發(fā)病率最高的為鐵7922（23.55%），發(fā)病率最低的為鄭58 （8.19%）；4份感病玉米自交系平均發(fā)病率為32.88%，發(fā)病率最高的為東237（51.26%），發(fā)病率最低的為81162（20.18%）；4份高感玉米自交系平均發(fā)病率為91.11%，發(fā)病率最高的為京七（94.83%），發(fā)病率最低的為U8112（83.60%）。

通過(guò)差值比較發(fā)現(xiàn)，在室內(nèi)人工接種條件下不同抗性級(jí)別自交系室內(nèi)接種后田間發(fā)病率均高于歷年田間接種發(fā)病率，其中高抗、抗病、中抗、感病和高感玉米自交系兩種接種方法發(fā)病率平均差值分別為3.71%、7.30%、6.11%、13.41%和12.46%。說(shuō)明優(yōu)化后的玉米絲黑穗病室內(nèi)人工接種侵染方法優(yōu)于傳統(tǒng)田間接種方法。

20份玉米自交系室內(nèi)接種田間鑒定發(fā)病率與20份自交系田間接種鑒定發(fā)病率作回歸分析（見(jiàn)圖2）。

圖2結(jié)果表明，二者呈極顯著正相關(guān)，方程為y=1.0894x+6.8184，相關(guān)系數(shù)r=0.9753（P<0.01）。且隨著田間接種鑒定發(fā)病率提高，室內(nèi)接種田間鑒定發(fā)病率也隨著升高。

表3　20份不同抗性級(jí)別自交系室內(nèi)接種田間平均發(fā)病率與歷年田間發(fā)病率的比較Table 3　Incidence rate of 20 maize inbred lines between infecting indoor and infecting in field over the years

圖2　20份自交系室內(nèi)接種田間鑒定發(fā)病率與歷年田間接種鑒定發(fā)病率的回歸分析Fig. 2　Regression analysis of incidence rate of 20 maize inbred lines between infecting indoor and infecting in field over the years

3　討論與結(jié)論

玉米絲黑穗病病菌主要在種子萌發(fā)至7葉期侵染中胚軸、胚根和胚芽等。在根系中以胚根侵染率最高，菌絲侵染幼苗后出現(xiàn)一個(gè)潛伏期，伴隨玉米生長(zhǎng)過(guò)程，苗期一些植株葉片會(huì)出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)，進(jìn)入開(kāi)花期后，在雄穗或雌穗上顯癥，出現(xiàn)充滿孢子堆的病癭。由于潛伏期長(zhǎng)且菌絲伴隨植株生長(zhǎng)，常規(guī)田間菌土接種鑒定方法須等到植株花期顯癥后，方能進(jìn)行發(fā)病率調(diào)查。研究表明，菌絲生長(zhǎng)不局限于生殖器官，臨近發(fā)病器官的莖和葉片以及苗期葉片、葉鞘等均能檢測(cè)到菌絲存在，且有些時(shí)期和部位在抗感材料中存在顯著差異[14-15]，這為玉米苗期絲黑穗病侵染率的檢測(cè)提供可能。

目前研究者已將PCR應(yīng)用到玉米絲黑穗病研究中，開(kāi)發(fā)多個(gè)針對(duì)玉米絲黑穗病菌檢測(cè)SSR標(biāo)記，其中標(biāo)記SR3[16]主要用于病菌侵染效果的檢測(cè)，而標(biāo)記oJS31[17]、AS15[18]主要用于病原菌遺傳多樣性等方面研究。病原菌侵染后檢測(cè)取樣部位主要為生長(zhǎng)點(diǎn)，但取樣后玉米幼苗則失去生長(zhǎng)能力。本研究前期對(duì)不同取樣部位進(jìn)行比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論抗病和感病玉米自交系生長(zhǎng)點(diǎn)的PCR檢測(cè)陽(yáng)性率均較高，無(wú)法辨別材料間抗性差異，而在人工接種后取玉米三葉期第3葉葉鞘進(jìn)行檢測(cè)，抗感材料間差異大，分辨效果好。因此本研究采用此取樣部位進(jìn)行PCR檢測(cè)，用以明確不同侵染條件下黃早四發(fā)病率差異，篩選出室內(nèi)接種絲黑穗病菌的最佳侵染條件為土壤濕度20%、菌土濃度1%、20℃光照培養(yǎng)8 h和15℃暗培養(yǎng)16 h的變溫培養(yǎng)。通過(guò)20份抗性不同的玉米自交系室內(nèi)接種后移栽到田間的發(fā)病率與多年田間接種發(fā)病率的關(guān)系驗(yàn)證侵染條件可靠性，結(jié)果表明在室內(nèi)人工接種條件下不同抗性級(jí)別玉米自交系室內(nèi)接種后的田間發(fā)病率均高于歷年田間直接接種發(fā)病率，說(shuō)明玉米絲黑穗病菌室內(nèi)最優(yōu)侵染條件下接種，相對(duì)于田間接種鑒定，排除侵染時(shí)期環(huán)境因素的影響，充分證明本試驗(yàn)確定的玉米絲黑穗病菌室內(nèi)接種條件可靠性，為今后苗期快速評(píng)價(jià)玉米資源對(duì)該病抗性提供可靠方法。

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Wang Zhenhua, Sun Peiyuan, Li Ningning, et al. Indoors infecting factors optimization of maize head smut under seedling stage[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(1): 1-5. (in Chinese with English abstract)

Indoors infecting factors optimization of maize head smut under seed?

ling stage

/WANG Zhenhua, SUN Peiyuan, LI Ningning, DI Hong, WANG Yuhe, LIU Xianjun,ZHANG Lin, YU Tao

(School of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:In this study, a high sensitive maize inbred line Huangzao4 was used to check indoors inoculation factors of maize head smut under seedling stage. Using the orthogonal design and PCR technology, we analyzed nine infection treatments and selected the best one based on multiple comparison results. Then the optimized method was identified in 20 maize inbred lines under indoor and field condition. The results showed that the optimized infection conditions of maize head smut fungus were that 20% soil moisture, 1% soil bacteria concentration, and culture condition was 8 h light at 20℃and 16 h dark at 15℃. The incidence of 20 inbred lines showed a significant positive correlation between infecting indoors and in field in several years using regression analysis. The results provided a powerful support to develop the rapid identification method indoor under seedling stage in maize.

Key words:maize; head smut; infecting indoors; inoculation factors

*通訊作者：王振華（1965-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橛衩走z傳育種。E-mail：zhenhuawang_2006@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371634）

收稿日期：2014-10-30

文章編號(hào)：1005-9369（2015）01-0001-05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.131