張 勤 劉亞風(fēng) 王曉夢(mèng) 張 芳 王 凱 高 潔

(河南出入境檢驗(yàn)檢疫局， 鄭州 450003)

隨著國(guó)際貿(mào)易往來(lái)的增加，媒介生物及其攜帶的病原體隨交通工具、貨物、行李等物件傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定和病原體監(jiān)測(cè)是疫病預(yù)防和控制的核心步驟。然而目前對(duì)媒介生物種類物種鑒定仍以形態(tài)學(xué)鑒定為主，但以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定存在樣本發(fā)育狀態(tài)、肢體完整性、專家依賴性等局限性，此外由于媒介生物種類繁多、近似種難以區(qū)分以及數(shù)據(jù)共享性差等因素，在實(shí)際工作中常常難以快速鑒別。自Hebert等(2003)在前人工作基礎(chǔ)上提出以線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I基因(COⅠ)為標(biāo)準(zhǔn)基因的DNA條形碼技術(shù)，隨后有關(guān)DNA條形碼 (DNA Barcoding) 的研究在世界各地開(kāi)展，目前已成功應(yīng)用于多個(gè)生物類群中。COⅠ基因比其他線粒體基因擁有更多的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)，其密碼子的第3位核苷酸表現(xiàn)出很高的堿基置換率，這使得COⅠ基因在分子進(jìn)化速率方面超出12S rDNA和16S rDNA兩倍之多(Pereiraetal., 2010)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子鑒定以其特有的優(yōu)勢(shì)成為形態(tài)學(xué)鑒定的有力補(bǔ)充。

本研究應(yīng)用DNA 條形碼技術(shù)對(duì)河南口岸入境截獲和本底調(diào)查中難以通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定的媒介生物進(jìn)行了DNA條形碼擴(kuò)增和序列比對(duì)，解決了在實(shí)際工作中的難題，充分顯示了DNA條形碼技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定補(bǔ)充作用。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的樣本為鄭州東站口岸截獲的1只形態(tài)不完整的蚊(孟加拉)和5只蜱(澳大利亞)、鄭州機(jī)場(chǎng)口岸本底調(diào)查中2只形態(tài)殘缺的蠅。DNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；PCR試劑盒、Premix TaqTM酶、DNA Marker、瓊脂糖和Gold View核酸染料、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和pMD18-T載體均購(gòu)自TaKaRa公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1引物：COⅠ基因擴(kuò)增通用引物L(fēng)CO1490：5′- G G T C A A C A A A T C A T A A A G A T A T T GG -3′和HCO2198：5′- T A A A C T T C A G G G T G A C C A A A A A A T CA -3′(Flomeretal., 1994)由Invitrogen公司合成。

1.2.2目的基因的擴(kuò)增: 分別取蜱、蚊、蠅樣本的一側(cè)后足，按照Qiagen DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。按照PCR試劑說(shuō)明書中推薦的引物、dNTP濃度作為初始擴(kuò)增條件，PCR反應(yīng)體系(25 μL): DNA模板2 μL，10 μmol/L LCO1490和HCO2198各1 μL，Premix TaqTM12.5 μL，ddH2O 8.9 μL，總體系25 μL，混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min；1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3序列分析：將截獲樣本的序列在BOLD Systems v3中進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果選取參考序列，使用MEGA 4.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果

2.1 COⅠ基因的擴(kuò)增

8份樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后凝膠電泳檢測(cè)，截獲的5只蜱、1只蚊以及本底的2只蠅均擴(kuò)增出700 bp左右的片段(圖1)，將擴(kuò)增產(chǎn)物送Invitrogen公司進(jìn)行序列測(cè)定。

圖1 DNA條形碼擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 CO I fragments of the 8 medical vectorsM:100 bp DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-5：5份蜱樣本CO I基因擴(kuò)增產(chǎn)物；6：蚊樣本CO I基因擴(kuò)增產(chǎn)物；7～8：2份蠅樣本CO I基因擴(kuò)增產(chǎn)物。M:100 bp DNA ladder；1- 5： 5 tick samples; 6：One mosquito sample；7-8： 2 local fly samples.

2.2 序列分析

2.2.1蜱樣本序列分析: 將5只蜱樣本的CO I序列在BOLD Systems v3中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示5只樣本與BOLD Systems v3中微小牛蜱序列同源性為99.55%～99.7%，在GenBank中選取同源性較近的微小扇頭蜱Rhipicephalusmicroplus、囊形扇頭蜱R.bursa、短小扇頭蜱R.pumilio、俄扇頭蜱R.rossicus、血紅扇頭蜱R.sanguineus、鐮形扇頭蜱R.haemaphysaloides、圖蘭扇頭蜱R.turanicus共計(jì)16條參考序列(表1)，對(duì)樣本(T1,T2,T3,T4,T5)以及16條參考序列COⅠ片段以Kimura 2 -parameter模式構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，結(jié)果顯示樣本均與微小牛蜱聚在一個(gè)分支，表明5只蜱樣本均為微小扇頭蜱。經(jīng)形態(tài)學(xué)檢查，其中3只為雄性，1只為雌性，1只為幼蜱。

表1 蜱參考序列信息Tab. 1 Information of COⅠ sequences of reference tick species

2.2.2蚊樣本序列分析: 蚊樣本COⅠ 序列與BOLD Systems v3中致倦庫(kù)蚊的同源性高達(dá)100%。在GenBank中選取尖音庫(kù)蚊復(fù)合組、按蚊亞科11條序列以Kimura 2 -parameter模式構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)，結(jié)果顯示尖音庫(kù)蚊復(fù)合組成員聚在一個(gè)分支，樣本與致倦庫(kù)蚊又獨(dú)立聚在一個(gè)小分支中，表明本次截獲蚊樣本應(yīng)為致倦庫(kù)蚊。

2.2.3蠅樣本序列分析: 2份蠅樣本中的1號(hào)蠅樣本在GenBank中與紫綠蠅Luciliaporphyrina同源性為100%，在BOLD Systems v3與紫綠蠅同源性為99.69%。鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示蠅

圖2 基于蜱CO I片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic analysis of the tick specimens based on CO I sequences

表2 蚊參考序列信息Tab. 2 Information of COⅠ sequences of reference mosquito species

樣1與紫綠蠅聚在同一小分支中(圖4)。2號(hào)蠅樣本在BOLD Systems v3和GenBank中比對(duì)后，結(jié)果顯示與銅腹重毫蠅Dichaetomyiabibax(KP161685.1)同源性為100%，而與其他蠅種同源性低于94%，經(jīng)形態(tài)特征比對(duì)后，確認(rèn)該樣本為銅腹重毫蠅。

表3 蠅參考序列信息Tab. 3 Information of fly COⅠ sequences

圖3 基于蚊CO I片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic analysis of the mosquito species on the sequences of CO I

圖4 基于蠅樣本CO I片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic analysis of the fly specimens based on CO I sequences

3 討論

大量研究結(jié)果證實(shí)COⅠ基因一段長(zhǎng)為648 bp的區(qū)域可作為動(dòng)物分類和鑒別的理想DNA條形碼(王穎等，2013)。每個(gè)物種都有唯一的COⅠ序列，COⅠ序列的種內(nèi)遺傳差異通常小于1%，極少數(shù)高于2%，但種間差異最小為2%，最高可達(dá)11.3%(Hebertetal., 2003)。近幾年來(lái)，基于COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)已成功應(yīng)用于魚類、鳥(niǎo)類和昆蟲等動(dòng)物的分類鑒定，在我國(guó)國(guó)境口岸蚊類鑒定工作中，DNA條形碼技術(shù)也成為形態(tài)學(xué)鑒定的有效補(bǔ)充(趙明等2008；趙峰等，2011；王剛等2012；魏曉雅等，2014；吳容泉等，2014；劉德星等，2015；常雪蓮等，2015)。

蜱是陸地脊椎動(dòng)物的專性、非永久性體外寄生蟲，它們?cè)谖逞旱耐瑫r(shí)還傳播著病毒、立克次體、細(xì)菌、螺旋體等各種病原體(王啟果等，2012)。微小扇頭蜱屬硬蜱科，扇頭蜱屬，主要分布于N30°與S48°之間的亞洲、美洲、非洲和大洋洲等地。在我國(guó)，微小扇頭蜱分布廣泛，寄生于蟲、大型動(dòng)物，牛、馬、羊、豬、狗、貓、兔等家畜和野生動(dòng)物，有時(shí)也襲擊人。微小扇頭蜱是森林腦炎病毒、貝氏立克次體(Q熱)、原蟲病、萊姆病旋體、牛巴貝斯蟲等病原體的傳播媒介(唐昊等，2015)。江莉等(2014)利用DNA條形碼技術(shù)鑒定出國(guó)內(nèi)首次截獲的肩突硬蜱；古小彬等(2010)通過(guò)ITS-2、COⅠ和COⅡ?qū)κ热貉绾烷L(zhǎng)角血蜱進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，證實(shí)它們是血蜱屬中親緣關(guān)系較近的兩個(gè)種類。

蚊類隸屬雙翅目，長(zhǎng)角亞目的蚊科，是國(guó)內(nèi)外研究最為廣泛和深入的昆蟲類別。蚊類中存在許多形態(tài)相似的復(fù)合組，以及口岸截獲的蚊類常常出現(xiàn)肢體殘缺等原因，對(duì)此類樣本難以進(jìn)行準(zhǔn)確的形態(tài)學(xué)鑒定。目前全世界已知的蚊種有40個(gè)屬，3 500多個(gè)亞種。經(jīng)由蚊類傳播的疾病有瘧疾、流行性乙型腦炎、黃熱病等80多種，因此蚊類是國(guó)境口岸監(jiān)測(cè)的重要醫(yī)學(xué)媒介生物。致倦庫(kù)蚊屬于尖音庫(kù)蚊復(fù)合組，該復(fù)合組還包括尖音庫(kù)蚊指名亞種、淡色庫(kù)蚊和騷擾庫(kù)蚊。其中致倦庫(kù)蚊和淡色庫(kù)蚊是我國(guó)主要的家棲蚊種，更是絲蟲病和乙型腦炎的重要傳播媒介。該復(fù)合組的各亞種形態(tài)頗為相似，其雄蚊陽(yáng)莖側(cè)板中葉的形態(tài)特征是種下分類的重要依據(jù)，陽(yáng)莖側(cè)板一側(cè)內(nèi)葉和中葉的間距與陽(yáng)徑兩中葉末端間距的比值(DV/D值)是該復(fù)合組的重要鑒別特征 (趙彤言等，1994)。

銅腹重毫蠅屬棘蠅亞科，重毫蠅屬，分布在我國(guó)吉林、遼寧、河北、山西、河南、廣東、云南、西藏等地。成蠅常在森林的樹(shù)葉、草地和糞便上停息，體長(zhǎng)約6.5 mm，體呈黑褐色，觸角第2節(jié)紅棕色，胸大部分為黑色，小盾片背基部和中央呈褐色，小盾下有淡色纖毛；后背中鬃3，翅側(cè)片具毛，腹側(cè)片鬃1∶2；翅下大結(jié)節(jié)褐色；M1+2脈末端明顯向前呈弧形彎曲；腹部呈黑褐色帶青銅金屬光澤(劉亞男，2012)。紫綠蠅屬麗蠅科，綠蠅屬,在我國(guó)廣泛分布。體呈紫色或青紫色金屬光澤；雄額狹，間額在最狹處消失，觸角特別長(zhǎng)；雌額亦狹，頭寬為額寬的3.5倍，側(cè)額和側(cè)顏等寬。后中鬃2對(duì)，前緣基鱗黑色，亞前緣骨片棕色，有黑色小剛毛l；腋瓣淡棕色至棕色，上腋瓣外緣呈淡棕色腹部背板后緣帶不明顯，第3背板無(wú)中緣鬃(陸寶麟等，2003)。近年來(lái)DNA條形碼技術(shù)在口岸蠅類鑒定中應(yīng)用廣泛。趙峰等(2011)應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)常見(jiàn)的4科10屬14種衛(wèi)生蠅類進(jìn)了鑒定，結(jié)果表明DNA條形碼鑒定與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相一致；吳榮泉等(2014)通過(guò)對(duì)福建省蠅類DNA條形碼的分析，證實(shí)COⅠ基因可用于麗蠅科中的各種的鑒定，但銅綠蠅和絲光綠蠅在進(jìn)化樹(shù)上不能完全分開(kāi)；劉德星等(2015)應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)鑒定出國(guó)內(nèi)未見(jiàn)分布的澳洲麻蠅。

本研究再次說(shuō)明，將DNA條形碼鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合的"綜合分類法(Integrated taxonomy)"能夠有效提高鑒定的效率和準(zhǔn)確性。