鄧成杰，王靜林，周 洋，何于雯，胡 奇，李華春

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明650224；2.云南省鎮(zhèn)雄縣畜牧獸醫(yī)局，云南鎮(zhèn)雄657200）

雜鱗庫蚊復(fù)合組包括三帶喙庫蚊（C.tritaeniorhynchus）、雜鱗庫蚊（C.vishnui）、環(huán)帶庫蚊（C.annulus）、偽雜鱗庫蚊（C.pseudovishnui）等數(shù)種親緣關(guān)系較為密切的蚊種［1］。該復(fù)合組中三帶喙庫蚊、斑帶庫蚊等是乙型腦炎病毒等多種蟲媒病毒的主要傳播媒介，在我國分布較為廣泛，也是我國南方地區(qū)的主要優(yōu)勢蚊種，主要吸血對象是人和家畜動(dòng)物，對人類和家畜動(dòng)物危害極大［2－3］。但是該復(fù)合組蚊蟲形態(tài)學(xué)上非常相似，用傳統(tǒng)形態(tài)分類的方法很難對這些蚊蟲進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定［4］。因此，本文對采集的雜鱗庫蚊進(jìn)行分子鑒定及COI基因序列分析，從分子水平了解三帶喙庫蚊等雜鱗庫蚊遺傳進(jìn)化關(guān)系，為研究我國蚊蟲分子分類提供資料，這對預(yù)防和控制以三帶喙庫蚊等雜鱗庫蚊為傳播媒介的疾病發(fā)生和傳播具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本采集 2013年5月在云南省江城縣農(nóng)戶牛圈采用誘蚊燈（功夫小帥，12V，300 mA，湖北武漢）采集標(biāo)本，采集時(shí)間約為18∶00至次日早晨8：00 共14h。次日早晨收集標(biāo)本，將標(biāo)本置于－20℃冰箱中冷凍20min～30 min，待存活的蚊蟲剛好冷凍死亡后，取出標(biāo)本根據(jù)蚊蟲形態(tài)學(xué)特征采用解剖鏡進(jìn)行蚊蟲形態(tài)學(xué)鑒定，將形態(tài)學(xué)鑒定為雜鱗庫蚊復(fù)合組蚊蟲標(biāo)本放入700 mL／L 乙醇中保存［5－6］。

1.2 方法

1.2.1 蚊蟲DNA 提取及PCR 擴(kuò)增 從乙醇中取出雜鱗庫蚊復(fù)合組蚊蟲標(biāo)本，用DNA 提取試劑盒（天根公司）按說明書提取蚊蟲DNA，操作步驟簡要如下：每只雜鱗庫蚊復(fù)合組蚊蟲標(biāo)本用緩沖液GA 200μL，充分研磨，加20μL ProteinaseK，56℃溫浴過夜，加200μL緩沖液GB混勻，70℃放置10min。加200μL無水乙醇充分混勻15min，過柱，分別用500μL緩沖液GD 和600μL 漂洗液PW 洗滌，加60μL洗脫緩沖液TE 洗脫DNA。取2μL cDNA做反應(yīng)模板，分別用COI基因特異引物［5］進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，依 次 加 入10×buffer 5 μL，2.5 mmol／L dNTP 5μL，上、下游引物各1.25μL，r Taq酶0.75 μL，去離子31.75μL，充分混勻。PCR 程序?yàn)?4℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃60s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，10mL／L 瓊脂糖電泳檢查擴(kuò)增條帶，用TaKaRa DNA fragment Purification Kit純化PCR 產(chǎn)物，PCR 產(chǎn)物通過華大基因公司進(jìn)行測序［7－9］。

1.2.2 序列分析 使用Clustal X Version 2.1 軟件包進(jìn)行病毒基因核苷酸序列比對，DNA Star 軟件中 Meg Align 進(jìn)行核苷酸同源性分析。用MEGA 4.1 軟件完成基于Neighbour－joining（NJ）方法的進(jìn)化樹繪制，Bootstrap值為1 000［10］。

2 結(jié)果

2.1 蚊蟲采集

2013年5月在江城縣共采集蚊蟲標(biāo)本148只，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定致倦庫蚊112只（75.67%）、三帶喙庫蚊12只（8.11%）、騷擾阿蚊17（11.49%）、其他蚊蟲7只（4.73%），表明了致倦庫蚊是當(dāng)?shù)? 月的優(yōu)勢蚊蟲種類。

2.2 核苷酸同源性分析

對云南省江城縣采集到的12只形態(tài)學(xué)鑒定為三帶喙庫蚊標(biāo)本（均為雌性，8只飽血，4只未吸血）進(jìn)行DNA 提取和COI基因PCR 擴(kuò)增，12只蚊蟲標(biāo)本擴(kuò)增均為陽性，經(jīng)序列測定獲得580個(gè)核苷酸序列。12只庫蚊COI基因核苷酸同源性在94.7%～100%，其中M2、M6、M7三只蚊蟲核苷酸同源性在99.5%～99.8%，M1、M3、M4、M5、M8、M9、M10、M11、M12共9 只蚊蟲核苷酸同源性在99.2%～99.8%，而兩者之間核苷酸同源性在94.7%～95.7%。12只庫蚊COI基因核苷酸與GenBank中雜鱗庫蚊復(fù)合組的三帶喙庫蚊、雜鱗庫蚊以及尖音庫蚊復(fù)合組的淡色庫蚊和致倦庫蚊相應(yīng)序列一起進(jìn)行分析（表1），M1、M3、M4、M5、M8、M9、M10、M11、M12共9只蚊蟲與三帶喙庫蚊核苷酸同源性最高為98%～100%，與雜鱗庫蚊和偽雜鱗庫蚊同源性分別在94.7%～95.5%和94.2%～94.5%，與尖音庫蚊復(fù)合組的淡色庫蚊和致倦庫蚊同源性均低于93.2%；M2、M6、M7三只蚊蟲與三帶喙庫蚊核苷酸同源性在94.8%～95.9%，與雜鱗庫蚊和偽雜鱗庫蚊同源性分別在94.4%～94.5%和93.9%～94.3%，與尖音庫蚊復(fù)合組的淡色庫蚊和致倦庫蚊同源性均低于92.2%。

表1 云南省江城縣雜鱗庫蚊復(fù)合組COI基因核苷酸序列同源性分析Table 1 The homologous analysis of COI genes of Culex vishnui complex in Jiangcheng County，Yunnan Province

2.3 遺傳進(jìn)化分析

云南省江城縣采集12只蚊蟲與GenBank中12條庫蚊COI基因序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。結(jié)果顯示所有24條庫蚊COI基因序列形成2個(gè)較大進(jìn)化分支，即雜鱗庫蚊復(fù)合組庫蚊進(jìn)化分支和尖音庫蚊復(fù)合組庫蚊進(jìn)化分支；云南省江城縣采集的12只蚊蟲序列位于雜鱗庫蚊復(fù)合組庫蚊進(jìn)化分支內(nèi)，提示云南省江城縣采集的12只蚊蟲標(biāo)本均為雜鱗庫蚊復(fù)合組庫蚊。進(jìn)一步對雜鱗庫蚊復(fù)合組庫蚊分析發(fā)現(xiàn)M1、M3、M4、M5、M8、M9、M10、M11、M12共9只蚊蟲與三帶喙庫蚊位于同一進(jìn)化分支內(nèi)，提示這9只庫蚊為三帶喙庫蚊；而M2、M6、M7蚊蟲明顯區(qū)別于雜鱗庫蚊復(fù)合組庫蚊的三帶喙庫蚊、雜鱗庫蚊和偽雜鱗庫蚊，單獨(dú)形成一個(gè)進(jìn)化簇，提示這3只蚊蟲為雜鱗庫蚊復(fù)合組的庫蚊，分類地位的確定還有待于進(jìn)一步的研究。

圖1 云南省江城縣采集雜鱗庫蚊復(fù)合組蚊蟲COI基因（600nt）遺傳進(jìn)化分析（◆代表本次采集蚊蟲標(biāo)本）Fig.1 Phylogenetic analysis of COI genes（600nt）of Culex vishnui complexs in Jiangcheng county，Yunnan province（Diamonds represent insects collected this time）

3 討論

DNA 序列分析是鑒定生物體不同種、亞種和地理株，以及研究其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的方法之一［11－12］。近年來，一些國內(nèi)外學(xué)者采用線粒體基因COI、COII、COIII和ITS基因序列以及其他一些基因作為分子靶標(biāo)進(jìn)行蚊蟲種類鑒定，其中線粒體基因COI進(jìn)化速率適中，在能夠保證足夠變異的同時(shí)又很容易被通用引物擴(kuò)增。目前，國內(nèi)外眾多學(xué)者采用COI基因作為分子靶標(biāo)對等翅目、跳蟲類和鞘翅目等昆蟲進(jìn)行深入研究，結(jié)果顯示無論在物種鑒定還是系統(tǒng)發(fā)育方面COI基因都是不錯(cuò)的選擇。因此，本次研究采用COI基因作為分子靶標(biāo)對云南省江城縣采集到的蚊蟲標(biāo)本進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示12只形態(tài)方法均鑒定為三帶喙庫蚊的標(biāo)本，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成2個(gè)進(jìn)化簇，這2個(gè)進(jìn)化簇的蚊蟲標(biāo)本之間的核苷酸同源性均低于95.7%，這個(gè)值明顯低于蚊蟲COI基因種內(nèi)判定值在98%以上［13－14］，表明這12只形態(tài)學(xué)鑒定為三帶喙庫蚊的標(biāo)本分屬于2種雜鱗庫蚊復(fù)合組不同庫蚊種。其中M1、M3、M4、M5、M8、M9、M10、M11、M12等9只蚊蟲與三帶喙庫蚊形成通一進(jìn)化簇，核苷酸同源性均在98%以上，表明這9只蚊蟲標(biāo)本為三帶喙庫蚊，而M2、M6、M7蚊蟲在雜鱗庫蚊復(fù)合組庫蚊中單獨(dú)形成一個(gè)進(jìn)化簇，與三帶喙庫蚊和雜鱗庫蚊核苷酸同源性均明顯低于98%，提示這三只蚊蟲并不是三帶喙庫蚊，而是雜鱗庫蚊復(fù)合組的一種庫蚊，分類地位的確定還有待于進(jìn)一步的研究。

蚊蟲是一類醫(yī)學(xué)上非常重要的昆蟲，其種類多，分布廣。不同蚊蟲種類的生活以及吸血等行為存在明顯差異，這些差異直接關(guān)系到蚊傳疾病的傳播、流行及分布，因此必須對蚊科昆蟲進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育的研究，從蚊蟲種群的演化歷史和進(jìn)化關(guān)系分析環(huán)境變遷因子對蚊類生物學(xué)特性的制約和影響，是解釋現(xiàn)存蚊類的生態(tài)特性和傳病關(guān)系的重要基礎(chǔ)。本次研究開展形態(tài)學(xué)上相似的雜鱗庫蚊復(fù)合組蚊蟲種類的分子鑒定和遺傳進(jìn)化關(guān)系的研究，避免了形態(tài)學(xué)對相近蚊蟲種類的錯(cuò)誤分類，從分子水平較好明確這些蚊蟲分類，為人和動(dòng)物蚊傳疾病的傳播控制提供科學(xué)依據(jù)。

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