司紅彬，吳永繼，徐素萍，黃麗云，秦 燕，姚曉韻，潘 婕，黃 凱＊，夏 娟，唐承明

（1廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；廣西南寧530005；2廣西壯族自治區(qū)獸藥監(jiān)察所；廣西南寧530001）

白頭翁為臨床常用清熱涼血藥之一，屬于毛莨科植物白頭翁Pulsatilla chinensis（Bunge）Regel的干燥根，多分布于河南、山東、吉林、黑龍江等地區(qū)。味苦性寒，歸胃、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、涼血止痢之功效，是治痢之要藥。臨床用于治療阿米巴痢疾、細(xì)菌性痢疾和抗陰道滴蟲(chóng)等疾病［1－3］?，F(xiàn)代研究表明該藥具有抗病毒［4］，對(duì)綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、痢疾桿菌有抑制作用［5］，也有研究報(bào)道該藥還具有抗炎、提高免疫力、保肝、抗腫瘤作用［6－7］，可能對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染有一定的治療和預(yù)防作用［8］。目前，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域也是如此，甚至連養(yǎng)殖領(lǐng)域的細(xì)菌對(duì)獸醫(yī)領(lǐng)域嚴(yán)禁使用的藥物都能產(chǎn)生耐藥性，如磷霉素。磷霉素為獸醫(yī)領(lǐng)域臨床嚴(yán)禁使用的藥物，目前分離到含該耐藥基因的文獻(xiàn)報(bào)道還不多［9］，理論上不應(yīng)該在獸醫(yī)領(lǐng)域分離到耐磷霉素基因（fosfomycin resistance gene，fosA3）的細(xì)菌。但2013年文獻(xiàn)報(bào)道中國(guó)從食品源動(dòng)物分離到10株產(chǎn)fosA3耐藥基因的大腸埃希菌［10］。本次試驗(yàn)分離到同時(shí)含有質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（extended spectrum betalactamases，ESBLs）和fosA3基因的大腸埃希菌，并通過(guò)白頭翁水提取物聯(lián)合抗菌藥對(duì)臨床分離同時(shí)含fosA3型和ESBLs型耐藥基因的大腸埃希菌體外抑菌效果進(jìn)行研究，為該類耐藥性細(xì)菌感染疾病的防治提供治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

白頭翁購(gòu)自廣西萬(wàn)豐藥業(yè)有限公司，腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管、MH 肉湯、SS瓊脂、麥康凱瓊脂均為杭州天河微生物試劑有限公司；抗菌藥：頭孢曲松鈉（ceftriaxone sodium）、阿莫西林（amoxicillin）、諾氟沙星（norfloxacin）、加替沙星（gatifloxacin）、鹽酸環(huán)丙沙星（ciprofloxacin）、左旋氧氟沙星（levofloxacin）、黏桿菌素（coly－mycin）、痢菌凈（mequindox）、磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine）、阿米卡星（amikacin）、頭 孢 他 啶（ceftazidime）、頭 孢 噻 呋 鈉（ceftiofur sodium）、氟苯尼考（florfenicol）、磷霉素（fosfomycin）均在有效期范圍內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定 從病雞的典型病變組織肝臟中無(wú)菌釣取部分病料，于麥康凱瓊脂平板和SS平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)18h，挑取單個(gè)菌落接種于MH 肉湯，進(jìn)行培養(yǎng)和再純化，然后按照生化鑒定管方法對(duì)菌落進(jìn)行鑒定。

1.2.2 白頭翁水提取物制備 稱取白頭翁100g，用蒸餾水清洗并浸泡4h，然后分別加入中藥體積的10、8、6倍體積的水進(jìn)行煎煮，煎煮時(shí)每次煮沸后改為文火繼續(xù)煎煮1h，過(guò)濾。合并3次濾液并進(jìn)行濃縮，使中藥的終濃度為1g／mL，高壓滅菌后冷藏備用。

1.2.3 中藥提取物和抗菌藥最小抑菌濃度的測(cè)定

參照CLSI（2008）［11］推薦的微量二倍稀釋法測(cè)定各藥物對(duì)分離到細(xì)菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concertration，MIC），并對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定該菌是否耐藥。

1.2.4 耐藥菌fosA3型和ESBLs型基因的檢測(cè)

1.2.4.1 引物合成 根據(jù)GenBank登錄的基因序列，設(shè)計(jì)fosA3 和ESBLs亞型引物：fosA3 上游引物：5′－GCGTCAAGCCTGGCATTT－3′；fosA3 下游引物：3′－GCCGTCAGGGTCGAGAAA－5′。TEM上游引物：5′－AGGAAGAGTATGATTCAACA－3′；TEM 下 游 引 物：5′－CTCGTCGTTTGGTATGGC－3′。CTX－M 上 游 引 物：5′－GGGCTGAGATGGTGACAAAGAG－3′；CTX－M 下 游 引 物：5′－CGTGCGAGTTCGATTTATTCAAC－3′。SHV 上游引物：5′－GGTTATGCGTTATATTCGCCTGTG－3′；SHV 下 游 引 物：5′－TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA－3′。以上引物全部由由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2.4.2 反應(yīng)體系 50μL 反應(yīng)體系：模板DNA 2μL，Taq 酶0.5μL，dNTP 4μL，buffer 5μL，上游、下游引物各2μL，去離子水34.5μL。不同類型和亞型基因的退火溫度為：fosA3（55℃）、TEM（52℃）、SHV（57℃）、CTX－M（55℃），設(shè)陰性對(duì)照，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外投射儀下觀察結(jié)果并用凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.2.5 中藥水提物與抗菌藥聯(lián)合誘導(dǎo)抑制試驗(yàn)以含有亞抑菌濃度的白頭翁水提取物的MH 肉湯作為培養(yǎng)基，聯(lián)合各抗菌藥傳代培養(yǎng)3次，采用常規(guī)2倍微量測(cè)定中西藥聯(lián)合對(duì)耐藥菌的MIC，觀測(cè)被中藥作用3代后細(xì)菌對(duì)抗菌藥MIC的變化。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

細(xì)菌純化培養(yǎng)后，該菌在麥康凱平板上為玫瑰紅色、圓形、表面光滑的菌落，在SS瓊脂平板上為紅色菌落（圖1）；將純化后的細(xì)菌接種生化培養(yǎng)鑒定管鑒定，確定為大腸埃希菌。

2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，該菌同時(shí)含有3個(gè)耐藥基因分別為fosA3型、TEM 型和CTX－M 型，見(jiàn)圖2。由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，結(jié)果表明，TEM 型擴(kuò)增產(chǎn)物堿基的長(zhǎng)度為521 bp，CTX－M 型擴(kuò)增產(chǎn)物堿基的長(zhǎng)度為876bp，fosA3擴(kuò)增產(chǎn)物堿基的長(zhǎng)度為258bp。

圖1 細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)Fig.1 Growth of colonies in different medium

2.3 單藥最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果及中西聯(lián)合作用細(xì)菌結(jié)果

白頭翁水提取物MIC 大于0.5g／mL。結(jié)果表明：各抗菌藥的單藥MIC 值較高（表1），根據(jù)CLSI（2010）判斷標(biāo)準(zhǔn)可判定該菌對(duì)各抗菌藥均表現(xiàn)為耐藥。中西聯(lián)合作用3代后，中藥可明顯降低各抗菌藥的MIC值，頭孢曲松鈉、阿莫西林、頭孢他啶、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考從第1代就開(kāi)始降低。

結(jié)果表明，以亞抑菌濃度白頭翁水提取物聯(lián)合抗菌藥對(duì)耐藥菌作用3 代，可使其MIC 值明顯降低，上述白頭翁水提取物對(duì)含fosA3型、TEM 型和CTX－M 型耐藥基因的大腸埃希菌對(duì)各抗菌藥的MIC均降低到原來(lái)1／4以下，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)可判斷白頭翁水提取物對(duì)耐藥大腸埃希菌具有較好的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，白頭翁聯(lián)合抗菌藥可對(duì)耐藥大腸埃希菌感染的疾病進(jìn)行較好的治療。

表1 抗菌藥單藥MIC和白頭翁水提物與抗菌藥聯(lián)合作用的MIC（μg／mL）Table 1 The MIC of antimicrobials and Pulsatilla chinensis water extract combination with antimicrobials

3 討論

白頭翁始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，藥用部位為其根。白頭翁根的主要有效成分為三萜皂苷、三萜酸、木脂素、胡蘿卜苷以及糖蛋白等成分［12］?，F(xiàn)代研究表明白頭翁素具有顯著的抗菌消炎和增強(qiáng)免疫功能的作用，可減輕腸道黏膜損傷并加速腸黏膜的修復(fù)［13］。白頭翁治療大腸埃希菌的研究報(bào)道也不少，有文獻(xiàn)報(bào)道白頭翁散對(duì)耐熱腸毒素大腸桿菌病治愈率為86%，效果顯著［14］，方向紅報(bào)道白頭翁的水提物抗豬大腸埃希菌效果不錯(cuò)［15］，李文超等［16］采用不同的溶媒對(duì)白頭翁進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)不同溶劑的提取物的都有抗菌效果，但作用效果差異不明顯。本試驗(yàn)采用水煮液，也發(fā)現(xiàn)白頭翁對(duì)耐藥菌具有一定的抑制作用，與文獻(xiàn)報(bào)道白頭翁對(duì)大腸埃希菌具有一定的抑菌作用報(bào)道一致。

目前中藥具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用的報(bào)道文獻(xiàn)也較多，并且不同的中藥具有耐藥逆轉(zhuǎn)的機(jī)理不同。中藥主要是通過(guò)以下機(jī)理實(shí)現(xiàn)耐藥逆轉(zhuǎn)作用：①中藥消除R 質(zhì)粒［17］；②中藥抑制β－內(nèi)酰胺酶。細(xì)菌產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶可以水解β－內(nèi)酰胺環(huán)類藥物，尤其產(chǎn)生的ESBLs［18］；③中藥影響細(xì)菌的生長(zhǎng)速度和蛋白表達(dá)量，進(jìn)而改變細(xì)菌的耐藥性［19－20］；④中藥對(duì)耐藥細(xì)菌外排泵抑制作用［21－22］。本次試驗(yàn)通過(guò)白頭翁水提取物連續(xù)誘導(dǎo)含3種耐藥基因的大腸埃希菌，發(fā)現(xiàn)被中藥提取物作用后的耐藥菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥的MIC明顯降低，且降低到原來(lái)MIC 的1／4以下，說(shuō)明白頭翁可讓耐藥大腸埃希菌對(duì)該試驗(yàn)中用到的抗菌藥具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用，至于其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。綜上所述，采用白頭翁水提取物聯(lián)合抗菌藥可以作為一種治療同時(shí)含fosA3 型、TEM 型和CTX－M 型耐藥基因的大腸埃希菌感染疾病的較好方案，可以用于臨床推廣。

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