許春燕，劉希望，楊亞軍，郭沂濤，李劍勇

（農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州730050）

中獸藥具有多靶點(diǎn)及病原微生物對(duì)其不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，在抗菌抗病毒的同時(shí)，還能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高機(jī)體抗病力，其在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用廣泛，取得了良好效果［1］。研究表明，中藥復(fù)方在防控禽類傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）方面有顯著的臨床效果［2］?？诜菏窃跍珓⑸┗A(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新劑型，具有劑量小、吸收較快、質(zhì)量穩(wěn)定、攜帶和服用方便、易于保存等優(yōu)點(diǎn)，在制劑中占有比例逐年上升［3］。

銀翹藍(lán)芩口服液由金銀花、連翹、板藍(lán)根、黃芩等中藥組成，是從中獸醫(yī)整體觀出發(fā)，辨證加減并通過(guò)臨床療效試驗(yàn)篩選后研制成的新型中獸藥產(chǎn)品。該口服液以傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論為基礎(chǔ)，運(yùn)用現(xiàn)代藥物制劑技術(shù)，經(jīng)過(guò)將金銀花、連翹、板藍(lán)根、黃芩等中藥材與水共煎煮醇沉等工藝，富集其有效成分制備而成。藥效學(xué)表明，銀翹藍(lán)芩口服液清熱解毒、解表平喘，具有抑菌、免疫促進(jìn)等藥學(xué)作用［4－5］。金銀花具有清熱解毒、抗病原微生物、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等作用，且對(duì)常見(jiàn)的呼吸道病毒有較強(qiáng)的抑制作用［6］，綠原酸是其主要有效成分，藥理活性顯著，常作為金銀花薄層色譜鑒別指標(biāo)［7］。連翹有辛涼清熱、芳香辟邪的功效，被認(rèn)為是中藥中的抗生素，其主要生物活性成分連翹苷具有較強(qiáng)抗菌作用，常作為連翹薄層鑒別指標(biāo)［8－9］。黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎之效，其有效成分黃芩苷對(duì)多種病毒有抑制作用，常選取黃芩苷作為黃芩薄層鑒別指標(biāo)［10－13］。苦參味苦，性寒，具有清熱燥濕，殺蟲利尿的功效，苦參堿及氧化苦參堿是其主要藥理活性成分，也是其薄層鑒別的常用指標(biāo)［14］。

薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）具有操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、分離效率高、專屬性好、分析快、色譜參數(shù)易調(diào)整等特點(diǎn)，在藥物分析中，特別是復(fù)方制劑中應(yīng)用廣泛［15－16］。為了更好的控制該復(fù)方口服液的產(chǎn)品質(zhì)量，本研究采用TLC法對(duì)該復(fù)方口服液中的金銀花、連翹、黃芩及苦參進(jìn)行了定性鑒別，為口服液質(zhì)量控制提供理論依據(jù)［17］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 供試品銀翹藍(lán)芩口服液，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所獸藥研究室自制；金銀花對(duì)照藥材（批號(hào)121060－201107）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753－200413）、連翹對(duì)照藥材（批號(hào)120908－201216）、連翹苷對(duì)照品（批號(hào)110821－201112）、黃芩對(duì)照藥材（批號(hào)120955－201008）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715－201117）、苦 參 對(duì) 照 藥 材（批 號(hào)121019－200106）、苦參堿（批號(hào)110805－200508）、氧化苦參堿對(duì)照品（批號(hào)110780－200506），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G 板（10cm×10cm），青島海洋化工有限公司產(chǎn)品；聚酰胺薄膜（10cm×10cm），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純；水為去離子水。

1.1.2 儀器設(shè)備 ME235S賽多利斯微量天平，北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品；DRT－SX 電子調(diào)溫電熱套，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；R－215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，BUCHI SWITZERLAND。

1.2 方法

1.2.1 金銀花薄層鑒別 取供試品銀翹藍(lán)芩口服液1mL，加甲醇1mL，制成供試品溶液。取金銀花粉末0.2g，加甲醇5mL，超聲30min，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照藥材溶液。取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方取金銀花外的其他中藥材，制得缺金銀花陰性口服液，按照供試品溶液制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。吸取上述4 種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一以0.04 g／mL醋酸鈉水溶液浸泡過(guò)的硅膠G 薄層板上，以乙酸丁酯－甲酸－水（7∶2.5∶2.5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.01g／mL 亞硝酸鈉甲醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

1.2.2 連翹薄層鑒別 取供試品銀翹藍(lán)芩口服液20mL，通過(guò)D101型大孔吸附樹脂（內(nèi)徑為2cm，柱高為10cm），用100mL 超純水洗脫，棄去洗液，再用乙醇－水（30∶70）溶液120mL洗脫，棄去洗液，最后用乙醇－水（50∶50）溶液120mL 洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。取連翹對(duì)照藥材0.5g，加甲醇10mL，超聲處理20min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。取連翹苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方取連翹外的其他中藥材，制得缺連翹陰性口服液，按照供試品溶液制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。吸取對(duì)照品溶液2μL，其余3種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇（5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.1mL／mL硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

1.2.3 黃芩薄層鑒別 取供試品銀翹藍(lán)芩口服液5mL，加水15mL，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至1，用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，合并兩次乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。取黃芩對(duì)照藥材0.5g，加乙酸乙酯－甲醇（3∶1）的混合溶液30mL，加熱回流30min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL 使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方取黃芩外的其他中藥材，制得缺黃芩陰性口服液，按照供試品溶液制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。吸取上述4種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄薄膜上，以甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（10∶6∶3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.02g／mL 三氯化鐵水溶液。供試品色譜中，應(yīng)在與對(duì)照品及對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

1.2.4 苦參薄層鑒別 取供試品銀翹藍(lán)芩口服液5mL，加水5mL，加濃氨試液1mL，混勻，用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL 使溶解，作為供試品溶液。取苦參對(duì)照藥材粗粉0.5g，加三氯甲烷10 mL，濃氨試液0.2mL，超聲處理15min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)尤燃淄?.5mL 使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取苦參堿對(duì)照品和氧化苦參堿對(duì)照品，加三氯甲烷制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方取苦參外的其他中藥材，制得缺苦參陰性口服液，照供試品溶液制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。吸取上述4種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－濃氨試液（8∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 金銀花薄層鑒別

3批供試品銀翹藍(lán)芩口服液的薄層色譜中，在與綠原酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的土褐色斑點(diǎn)；在與金銀花對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色3個(gè)斑點(diǎn)；陰性對(duì)照品在相同位置無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)，即該方法陰性對(duì)照無(wú)干擾，方法具有專一性（圖1）。

圖1 銀翹藍(lán)芩口服液中金銀花TLC圖Fig.1 TLC of Lonicera japonicain Yinqiao lanqin oral liquid

2.2 連翹薄層鑒別

3批供試品銀翹藍(lán)芩口服液的薄層色譜中，在與連翹苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的紅褐色斑點(diǎn)；在與連翹對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)；連翹陰性對(duì)照在相同位置無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)，即陰性對(duì)照無(wú)干擾，方法具有專一性（圖2）。

圖2 銀翹藍(lán)芩口服液中連翹TLC圖Fig.2 TLC of Forsythia suspensain Yinqiao lanqin oral liquid

2.3 黃芩薄層鑒別

3批供試品銀翹藍(lán)芩口服液的薄層色譜中，與黃芩苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的墨綠色斑點(diǎn)；與黃芩對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照在相同位置無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)，即陰性對(duì)照無(wú)干擾，方法具有專一性（圖3）。

圖3 銀翹藍(lán)芩口服液中黃芩TLC圖Fig.3 TLC of Scutellaria baicalensis in Yinqiao lanqin oral liquid

2.4 苦參薄層鑒別

3批供試品銀翹藍(lán)芩口服液的薄層色譜中，在與苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同橘紅色斑點(diǎn)；在與苦參對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同橘紅色斑點(diǎn)；苦參陰性對(duì)照在相同位置無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)，即陰性對(duì)照無(wú)干擾，方法具有專一性（圖4）。

3 討論

圖4 銀翹藍(lán)芩口服液中苦參TLC圖Fig.4 TLC of Sophora flavescens in Yinqiao lanqin oral liquid

根據(jù)《中國(guó)獸藥典》中各味藥材及其他復(fù)方制劑中相應(yīng)中藥材的薄層色譜鑒別方法，通過(guò)試驗(yàn)，確定了金銀花、連翹、黃芩及苦參的定性鑒別方法。在金銀花的鑒別中，起初參照《中國(guó)獸藥典》2010年版二部金銀花藥材薄層鑒別方法試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法分離度較差，且斑點(diǎn)不清晰。后參照《中國(guó)藥典》2010年版一部小兒感冒寧糖漿質(zhì)量控制研究中金銀花的鑒別方法，展開劑合適，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，方法專一。在連翹的鑒別中，起初參照《中國(guó)獸藥典》2010年版二部中連翹藥材薄層鑒別方法試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連翹苷由于含量較低，薄層鑒別的斑點(diǎn)不明顯。因此，嘗試了用乙酸乙酯提取、濃縮，提高連翹苷含量的方法，效果仍不明顯。原因可能是連翹苷屬于大極性化合物，在水中溶解度較高，乙酸乙酯萃取并不能有效富集連翹苷。最終參考《中國(guó)藥典》2010年版一部清熱解毒口服液中連翹的鑒別定方法，采用大孔吸附樹脂富集連翹苷并除去其他雜質(zhì)，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰，方法專一。在黃芩的鑒別中，起初參照《中國(guó)獸藥典》2010 年版二部黃芩藥材的薄層鑒別方法試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離度較差，且其他成分干擾較嚴(yán)重。最后參照《中國(guó)藥典》2010 年版一部小兒感冒顆粒質(zhì)量控制研究中黃芩的鑒別方法，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，方法專一。在苦參的鑒別中，參照《中國(guó)獸藥典》2010 年版二部藥材苦參的薄層鑒別方法試驗(yàn)，對(duì)口服液樣品及陰性對(duì)照品采用加適量氨水游離出苦參堿和氧化苦參堿，再用三氯甲烷提取濃縮的辦法進(jìn)行富集、除雜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法分離度好，斑點(diǎn)清晰，方法專一。

本中獸藥復(fù)方口服液為清熱解毒、解表平喘的新獸藥產(chǎn)品，為了該復(fù)方口服液的推廣使用，需建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以保證復(fù)方口服液的質(zhì)量。本研究采用的TLC法可以對(duì)該復(fù)方口服液的主要藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別，且方法簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)，因此可以達(dá)到控制銀翹藍(lán)芩口服液質(zhì)量的目的。

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