張 倩，齊曉楠，楊文浩，叢 霞，李華濤，曹榮峰，田文儒

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109）

牛雄性生殖干細(xì)胞（male germ stem cell，mGSC）是位于睪丸曲細(xì)精管基膜上，具有增殖和分化潛能的干細(xì)胞，能夠產(chǎn)生精子，將遺傳信息傳給后代［1］。Brinster R L等［2］將可育小鼠的雄性生殖干細(xì)胞移植到不育小鼠的睪丸中建立了精子發(fā)生。生殖干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為克隆動(dòng)物［3］、治療雄性不育以及一些人類遺傳疾病的細(xì)胞治療［4］提供了新的機(jī)遇與途徑。

目前mGSC的研究主要包括其分離純化與鑒定，構(gòu)建穩(wěn)定增殖的mGSC體外培養(yǎng)體系［5］。Kanatsu-Shinohara M 等［6］首次建立了小鼠生殖干細(xì)胞體外長期培養(yǎng)體系，并成功獲得了多能性生殖干細(xì)胞。然而，睪丸生殖細(xì)胞的研究多集中在鼠等小動(dòng)物上，大動(dòng)物生殖干細(xì)胞的體外研究比較困難，其分離和培養(yǎng)條件扔處于摸索階段［7］?？偨Y(jié)近年來的研究發(fā)現(xiàn)，牛睪丸生殖干細(xì)胞所采用的培養(yǎng)條件相差各異，且一直未建立穩(wěn)定的體外長期培養(yǎng)體系。睪丸生殖干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)是進(jìn)行生殖干細(xì)胞功能活性鑒定和精子發(fā)生機(jī)理等研究的基礎(chǔ)。因此，建立牛睪丸生殖干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系具有重要科研意義。

目前體外培養(yǎng)睪丸生殖干細(xì)胞多采用將分離純化到的生殖干細(xì)胞接種于支持細(xì)胞或成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的方法，同時(shí)培養(yǎng)基中成分復(fù)雜，多添加多種營養(yǎng)因子如干細(xì)胞生長因子（stem cell factor，SCF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子（glialcellline derived neurotrophic factor，GDNF）、分化誘導(dǎo)因子（differentiation inducing factor，DIF）和谷氨酰胺等［8］，然而，生精干細(xì)胞的分離純化不僅工作繁瑣而且細(xì)胞密度選擇仍需摸索，同時(shí)所添加的營養(yǎng)因子價(jià)格昂貴。為此，本試驗(yàn)探索了在培養(yǎng)基不添加營養(yǎng)因子的情況下，通過優(yōu)化睪丸支持細(xì)胞密度的方法共培養(yǎng)睪丸生殖干細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 取初生犢牛睪丸，酒精消毒后用PBS或生理鹽水沖洗，浸泡于含100mL／L雙抗的PBS緩沖液中，于冰上2h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 膠原酶Ⅳ、胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM F-12、新生牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；AKP試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品；100×青鏈霉素混合液為索萊寶公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒為原平皓公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；LightCycler?480SYBR GreenⅠ Master為Roche公司產(chǎn)品；試驗(yàn)用水均為超純水，本試驗(yàn)中所用試劑除特別說明的以外，其余均為分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 睪丸支持細(xì)胞和生殖干細(xì)胞混合細(xì)胞懸液的制備和培養(yǎng) 犢牛睪丸曲細(xì)精管上皮只有2種細(xì)胞，即睪丸支持細(xì)胞和睪丸生殖干細(xì)胞。獲取犢牛睪丸曲細(xì)精管上皮細(xì)胞懸液采用兩步酶消化法。除去附睪、脂肪墊、微血管及睪丸白膜，撥散睪丸組織小塊后吸管吹打、靜置離心獲取曲細(xì)精管小段。1.5g／L膠原酶溶液室溫振蕩消化10min后1 000 r／min離心5min，然后2.5g／L胰酶溶液37℃消化5min，終止消化后400目篩網(wǎng)過濾，1 000r／min離心5min，棄上清后用含100mL／L胎牛血清的DMEM-F12重懸細(xì)胞，得到支持細(xì)胞和生殖干細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液。

1.2.2 HE染色 待混合培養(yǎng)的犢牛睪丸曲細(xì)精管上皮細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿時(shí)進(jìn)行HE染色：用PBS清洗細(xì)胞后加入950mL／L乙醇室溫固定15min；洗滌后加入蘇木精室染8min，自來水藍(lán)化10min后加入10mL／L伊紅水溶液染色15s，水洗拍照。

1.2.3 AKP（堿性磷酸酶）染色鑒定 待混合培養(yǎng)的兩種細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞集落時(shí)進(jìn)行AKP鑒定：洗滌細(xì)胞后用40mL／L多聚甲醛室溫固定2min，洗棄固定液后加入2mL BCIP／NBT工作液（用2mL堿性磷酸酶顯色緩沖液、6.67μL BCIP（300×）和13.3μL NBT（150×）配制 BCIP／NBT 染色工作液）充分覆蓋樣品，然后室溫避光孵育1h，去除工作液后蒸餾水洗滌終止顯色反應(yīng)并拍照。

1.2.4 睪丸生殖干細(xì)胞的純化及試驗(yàn)分組 為獲取純度較高的生殖干細(xì)胞懸液，對(duì)于原代培養(yǎng)的牛睪丸細(xì)胞在接種培養(yǎng)12h后吸取上清。此時(shí)支持細(xì)胞已貼壁完全，干細(xì)胞部分貼壁，因此獲取的上清細(xì)胞懸液為睪丸生殖干細(xì)胞。以1 000r／min離心5min，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)／mL，準(zhǔn)備接種與支持細(xì)胞上。選擇不同生長密度的支持細(xì)胞共培養(yǎng)睪丸生殖干細(xì)胞。待純化培養(yǎng)的第3代支持細(xì)胞分別長到約225、1 300、5 600個(gè)／cm2時(shí)接種密度為1×104個(gè)／mL的生殖干細(xì)胞細(xì)胞懸液1mL，用25 mL／L血清濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)6d時(shí)，任選5個(gè)視野，記錄集落數(shù)并計(jì)算集落與支持細(xì)胞的比例。

1.2.5 RT-PCR方法檢測特異性基因SCF、OCT-4的表達(dá) 提取不同密度支持細(xì)胞共培養(yǎng)體系的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后檢測支持細(xì)胞的標(biāo)志基因SCF和生殖干細(xì)胞OCT-4的表達(dá)（表1），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)條件為94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃20s，40個(gè)循環(huán)；72℃7min。

表1 引物列表Table 1 Primer information of RT-PCR

1.2.6 熒光定量PCR方法檢測SCF、OCT-4mRNA表達(dá) 提取不同密度支持細(xì)胞共培養(yǎng)體系的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后將合成的cDNA產(chǎn)物做一系列濃度梯度稀釋，用 Roche Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀進(jìn)行定量反應(yīng)，反應(yīng)體系（10μL）：ddH2O 3.6μL；SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5μL；上、下游引物（20pmoL／μL ）各0.2μL（表1）；cDNA 1μL。反應(yīng)條件：95℃ 10min；95℃10s，60℃20s，72℃30s，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，各組細(xì)胞以GAPDH做為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行相對(duì)定量分析，其中ΔCT＝目的基因CT-內(nèi)參基因 CT；ΔΔCT＝ 試驗(yàn)組 ΔCT-對(duì)照組ΔCT［1］。

2 結(jié)果

2.1 犢牛睪丸支持細(xì)胞和生殖干細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)

睪丸支持細(xì)胞貼壁后呈長條形，貼壁生長性強(qiáng)，在培養(yǎng)皿底壁逐漸生長成樹枝狀；支持細(xì)胞的細(xì)胞核多位于細(xì)胞基部，呈橢圓形，核仁明顯，常有多個(gè)（圖1和圖2）；HE染色后，支持細(xì)胞胞核嗜堿性弱，染色較淺（圖2）。

睪丸生殖干細(xì)胞較支持細(xì)胞貼壁晚，常貼于支持細(xì)胞上或其附近，細(xì)胞貼壁后呈圓形或橢圓形；細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，核質(zhì)比較大；生精細(xì)胞常聚集生長，形成細(xì)胞團(tuán)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長增殖能力強(qiáng)的生殖干細(xì)胞逐漸形成細(xì)胞集落；細(xì)胞集落亮度大，多呈圓形，突出生長（圖1和圖2）；HE染色后，睪丸生殖干細(xì)胞細(xì)胞膜多數(shù)完整光滑，細(xì)胞核嗜堿性較強(qiáng)染色較深（圖2）。

圖1 犢牛睪丸支持細(xì)胞和生殖干細(xì)胞混合培養(yǎng)（A～B.Bar＝100μm，C～D.Bar＝30μm）Fig.1 The mixed culture of calf testis SCs and GSCs（A-B.Bar＝100μm；C-D.Bar＝30μm）

圖2 犢牛睪丸支持細(xì)胞和生殖干細(xì)胞混合培養(yǎng)（HE，Bar＝100μm）Fig.2 The mixed culture of calf testis SCs and GSCs（HE，Bar＝100μm）

2.2 共培養(yǎng)體系中牛睪丸生殖干細(xì)胞的生長特征

培養(yǎng)睪丸曲細(xì)精管上皮細(xì)胞懸液12h后棄上清并將血清濃度換成25mL／L繼續(xù)混合培養(yǎng)兩種細(xì)胞，3d后生殖干細(xì)胞增殖較快，多集中生長并漸漸出現(xiàn)發(fā)亮的集落（圖3a），4d后生殖干細(xì)胞生長進(jìn)入指數(shù)階段，于支持細(xì)胞上層生長旺盛（圖3b），6d時(shí)集落數(shù)進(jìn)一步增加（圖3c），然而培養(yǎng)皿中細(xì)胞總量已很大，繼續(xù)培養(yǎng)出現(xiàn)接觸抑制。原代培養(yǎng)的混合細(xì)胞，當(dāng)干細(xì)胞基本鋪滿上層時(shí)進(jìn)行AKP染色，原代干細(xì)胞集落染色多呈輻射狀（圖4）。

2.3 不同密度的第3代支持細(xì)胞培養(yǎng)生殖干細(xì)胞

用低接種密度（225個(gè)／cm2）支持細(xì)胞共培養(yǎng)生殖干細(xì)胞時(shí)，長出的生殖干細(xì)胞集落比例最大，且干細(xì)胞集落純度較大、集落體積也較大（圖5a）。用中接種密度（1 300個(gè)／cm2）和高接種密度（5 600個(gè)／cm2）支持細(xì)胞共培養(yǎng)生殖干細(xì)胞時(shí)，支持細(xì)胞增長速度快于生精細(xì)胞，干細(xì)胞集落比例較低，體積較小，由于支持細(xì)胞細(xì)胞速度生長較快，鋪滿平皿后出現(xiàn)接觸抑制（圖5b和圖5c）。

圖3 犢牛睪丸曲細(xì)精管上皮細(xì)胞培養(yǎng)（Bar＝100μm）Fig.3 The cultute of calf testis seminiferous tuble epithelial cells（Bar＝100μm）

圖4 犢牛睪丸生殖干細(xì)胞的AKP染色（Bar＝60μm）Fig.4 The calf testis GSCs with AKP-staining（Bar＝60μm）

表2 各組共培養(yǎng)體系中生殖干細(xì)胞集落比例數(shù)Table 2 The clones′proportion in different co-culrute system

圖5 4d時(shí)不同密度支持細(xì)胞共培養(yǎng)體系細(xì)胞圖（a.Bar＝50μm；b～c.Bar＝100μm）Fig.5 The co-culture system with different density of SCs on the fourth day（a.Bar＝50μm，b-c.Bar＝100μm ）

2.4 牛睪丸支持細(xì)胞和生殖干細(xì)胞特異性基因的鑒定

RT-PCR結(jié)果顯示分析不同密度SC培養(yǎng)GSC時(shí)，各密度培養(yǎng)體系均表達(dá)干細(xì)胞特異基因OCT-4和支持細(xì)胞特異基因SCF（圖6）。

圖6 不同密度共培養(yǎng)體系中牛睪丸生殖干細(xì)胞和支持細(xì)胞標(biāo)志基因RT-PCR鑒定Fig.6 Identification of calf mGSC and SC markers by RT-PCR in different density co-culture systems

2.5 不同密度支持細(xì)胞共培養(yǎng)體系中SCF、OCT-4的相對(duì)表達(dá)量

熒光定量PCR結(jié)果顯示，采用低密度SC培養(yǎng)干細(xì)胞特異性基因OCT-4的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于中密度SC培養(yǎng)和高密度SC培養(yǎng)（P＜0.01）；中密度和高密度間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖7 OCT-4和SCF灰度比值Fig.7 The gray value of OCT-4／SCF

3 討論

構(gòu)成曲細(xì)精管的上皮是一種特殊的復(fù)層上皮，管壁上皮細(xì)胞分支持細(xì)胞和生精細(xì)胞兩類，支持細(xì)胞分布在各級(jí)生精細(xì)胞之間［9］，對(duì)生精細(xì)胞具有營養(yǎng)、支撐、保護(hù)等多種作用［10］。以支持細(xì)胞為飼養(yǎng)層體外共培養(yǎng)時(shí)，支持細(xì)胞貼壁較早，能夠產(chǎn)生較大的伸展面積，有利于生殖干細(xì)胞貼壁［11］；同時(shí)支持細(xì)胞會(huì)分泌多種生物活性因子，如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源營養(yǎng)因子（GDNF1）［12］、干細(xì)胞因子（SCF）［13］等以促進(jìn)干細(xì)胞的增殖；此外，支持細(xì)胞之間以及支持細(xì)胞和干細(xì)胞之間形成的特殊連結(jié)構(gòu)成了生精細(xì)胞生長的微環(huán)境，同時(shí)有利于某些調(diào)節(jié)因子的信號(hào)傳導(dǎo)［14］。

因此，目前培養(yǎng)睪丸生殖干細(xì)胞多采用以支持細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞做飼養(yǎng)層［15］，同時(shí)為促進(jìn)生殖干細(xì)胞增殖，選用的培養(yǎng)基條件嚴(yán)格，通常加入多種昂貴的營養(yǎng)因子［8］。其目的是更好的促進(jìn)干細(xì)胞生長，以期進(jìn)一步純化干細(xì)胞，提高干細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中的比例。鑒于此，本試驗(yàn)對(duì)接種睪丸干細(xì)胞前的支持細(xì)胞飼養(yǎng)層密度進(jìn)行了選擇，在不添加SCF、GDNF等昂貴營養(yǎng)因子的條件下，簡便、經(jīng)濟(jì)、有效地培養(yǎng)睪丸生殖干細(xì)胞。

3.1 共培養(yǎng)體系中睪丸支持細(xì)胞和生殖干細(xì)胞的鑒定

根據(jù)李德雪等的研究方法［16-19］，本試驗(yàn)HE染色結(jié)果、光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果以及AKP染色結(jié)果顯示，體外混合培養(yǎng)的犢牛睪丸曲細(xì)精管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)睪丸支持細(xì)胞和生精細(xì)胞的兩種形態(tài)特征。根據(jù)于磊等［20］對(duì)睪丸支持細(xì)胞及張仕強(qiáng)等［21］對(duì)睪丸生殖干細(xì)胞特異性標(biāo)志物的鑒定，本試驗(yàn)經(jīng)RTPCR發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)的細(xì)胞均能夠表達(dá)睪丸支持細(xì)胞特異基因SCF和干細(xì)胞特異基因OCT-4；同時(shí)熒光定量PCR結(jié)果說明，隨著支持細(xì)胞密度的不同，SCF和OCT-4的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生變化，即生殖干細(xì)胞和支持細(xì)胞數(shù)量比發(fā)生變化，OCT-4／SCF比值越高則干細(xì)胞比例越大。

3.2 共培養(yǎng)時(shí)睪丸支持細(xì)胞密度的選擇

曲細(xì)精管上皮內(nèi)的支持細(xì)胞和生精細(xì)胞須要保持一定的比例，有利于生精細(xì)胞的發(fā)育及精子的產(chǎn)生［22］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低密度的支持細(xì)胞培養(yǎng)生殖干細(xì)胞能夠顯著增加干細(xì)胞集落比例數(shù)及集落體積；同時(shí)顯著升高干細(xì)胞特異性基因OCT-4／支持細(xì)胞特異性基因SCF。說明雖然支持細(xì)胞是體外培養(yǎng)生殖干細(xì)胞的不可或缺因素，但是，支持細(xì)胞跟生精細(xì)胞的比例卻不是越大越好。高密度的支持細(xì)胞并不利于生殖干細(xì)胞集落的生成，即高密度支持細(xì)胞不利于生殖干細(xì)胞的增殖。其原因可能是：支持細(xì)胞密度高，其吸收營養(yǎng)過多、產(chǎn)生的細(xì)胞代謝產(chǎn)物也較多，同時(shí)支持細(xì)胞增殖速度較快不能給生殖干細(xì)胞足夠的生長空間，從而抑制生殖干細(xì)胞的增殖；而較低密度的支持細(xì)胞共培養(yǎng)既能滿足生殖干細(xì)胞的生長要求，又不至于吸收過多的營養(yǎng)、產(chǎn)生過多代謝產(chǎn)物以及搶占生存空間，因此干細(xì)胞集落純度較大。

體外培養(yǎng)睪丸生殖干細(xì)胞時(shí)，采用較低密度的支持細(xì)胞共培養(yǎng)可獲得理想的睪丸生殖干細(xì)胞。這種方法既節(jié)省了昂貴的外加營養(yǎng)因子，同時(shí)操作簡便、效果理想。然而，根據(jù)理論猜測，密度并非越低越好，因此還需進(jìn)一步試驗(yàn)，以篩取更佳的支持細(xì)胞共培養(yǎng)密度。

［1］Schlatt S.Spermatogonial stem cell preservation and transplantion［J］.Mol Cell Endocrinol，2002，187（1-2）：107-111.

［2］Brinster R L，Zimmermann J W.Spermatogenesis following male germ-cell transplantation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91：11298-11302.

［3］Hiroshi K，Brinster R L.Technology insight：invitroculture of spermatogonial stem cells and their potential therapeutic uses［J］.Nat Rev Endocrinol，2006（2）：99-108.

［4］Honaramooz A，Megee S，Zeng W X，et al.Adeno-associated virus（AAV）-mediated transduction of male germ linestem cells results in transgene transmission after germ cell transplantation［J］.Faseb J，2008，22：374-382.

［5］Cheng G，F(xiàn)eng S T.Studies on spermatogonial stem cells culturedinvitroof Wuzhishan mini porcine［J］.Chinese J Biotechnol，2006，22（4）：689-693.

［6］Kanatsu-Shinohara M，Miki H，Inoue K，et al.Long-term culture of mouse male germline stem cells under serum-or feeder-free conditions［J］.J Biol Repord，2005，72（4）：985-991.

［7］Goel S，Sugimoto M，Minami N，et al.Identification，isolation，andinvitroculture of porcine gonocytes［J］.J Biol Reprod，2007，77（1）：127-137.

［8］Nasiri Z L，Hosseini S M，Hajian M，et al.Effects of different feeder layers on short-term culture of prepubertal bovine testicular germ cellsinvitro［J］.Theriogenology，2012，77（8）：1519-28.

［9］Russell L D，Tallon-Doran M，Weber J E，et al.Three-dimensional reconstruction of a rat stage V Sertoli cell：III.A study of specific cellular relationships［J］.J Anatomy，1983，167：181-192.

［10］Bardin W C，Gunsalus G L，Chemgh C Y.The cell biology of the Sertoli cell［J］.Cell Mol Biol Test，1993，189-219.

［11］Saitou M，Barton S C，Surani M A.A molecular programme for the specification of germ cell fate in mice ［J］.Nature，2002，418：293-300.

［12］Simon L，Ekman G C，Tyagi G.Common and distinct factors regulate expression of mRNA for ETV5and GDNF，Sertoli cell proteins essential for spermatogonial stem cell［J］.Exp Cell Res，2007，313（14）：3090-3099.

［13］Ohta H，Yomogida K，Dohmae K，et al.Regulation of proliferation and differentiation in spermatogonial stem cells：the role of c-kit and its ligand SCF［J］.Development，2000，127：2125-2131.

［14］Wang R S，Yeh S，Chen L M，et al.Androgen receptor in Sertoli cell is essential for germ cell nursery and junctional complex formation in mouse testes［J］.Endocrinology，2006，147（12）：5624-33.

［15］劉慧蓮，趙光強(qiáng).Sertoli細(xì)胞飼養(yǎng)層對(duì)小鼠精原干細(xì)胞增殖的影響［J］.中國生物工程雜志，2007，27（2）：95-98.

［16］李德雪，張學(xué)明，賴良學(xué)，等.小鼠精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)的一般特性［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，21（1）：160-163.

［17］Dirk G.Proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells［J］.Reproduction，2001，121：347-354.

［18］Izadyar F，Den-Ouden K，Creemers L B，et al.Proliferation and differentiation of bovine type A spermatogonia during long-term culture［J］.Biol Reprod，2003，68：272-281.

［19］Zheng P，Huang Z J，Lv Z H，et al.Study of several factors affecting on preparation of mouse embryonic stem cells［J］.Life Sci J，2009，6（1）：1-4.

［20］于 磊，鄭 鵬，榮恩光，等.新生牛睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定分析［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（1）：63-66.

［21］張仕強(qiáng)，畢聰明，彭樹英，等.不同培養(yǎng)條件對(duì)牛精原干細(xì)胞增殖的影響與特性鑒定［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38（6）：542-547.

［22］Allan D J，Harmon B V，Robrets S A.Spermatogonial apoptosis has three morphologically recognizable phases and shows no circadian rhythm during normal spermatogenesis in the rat［J］.Cell Prolif，1992，25：241-250.