郭　威，胡仕鳳，王衛(wèi)國，何世成，唐小明，林　源，魯杏華，王昌建*

(1. 湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙 410128；2.湖南省動物疫病預防控制中心，湖南長沙 410019)

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環(huán)洞庭湖地區(qū)活禽市場鴨源NDV的分離鑒定及遺傳演化分析

郭威1，胡仕鳳1，王衛(wèi)國2，何世成2，唐小明2，林源2，魯杏華2，王昌建2*

(1. 湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙 410128；2.湖南省動物疫病預防控制中心，湖南長沙 410019)

摘要：從洞庭湖地區(qū)周邊縣市幾個活禽市場的健康家鴨中分離到14株具有血凝性的病毒，通過血凝、血凝抑制試驗及RT-PCR鑒定，其中1株為新城疫病毒，命名為Duck/hunan/yy858/14。通過對該病毒的F基因全長擴增，并轉化、克隆、測序及構建F基因的遺傳進化樹，推導其核苷酸序列。序列測定及遺傳進化分析顯示，該毒株F基因全長為1 792 bp，ORF為1 662 bp，可編碼553個氨基酸，其氨基酸裂解位點的組成為112ERQERL117，具有典型新城疫病毒弱毒的分子特征，與我國內地首次分離到的Class I 毒株NDV08-004、吉林野鳥毒株J36/13、香港活禽市場分離株Chicken/HongKong/1525.16/2005在同一分支，屬Class I類基因3型。同源性分析顯示該毒株與ClassⅡ中弱毒疫苗株V4和La Sota的核苷酸及氨基酸的同源性均較低，分別為73.4%和71.6%；與香港活禽市場分離株Chicken/HongKong/1525.16/2005和首例內地分離到的鴨源新城疫病毒毒株Duck/China/08-004/2008的核苷酸同源性分別為91.2%、91.0%；與吉林野鳥毒株J36/13的核苷酸同源性最高為98.3%，推測與野鳥毒株有共同來源。

關鍵詞：活禽市場；鴨源NDV；分離鑒定；遺傳進化分析

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬，僅有一個血清型，其宿主廣泛，能導致雞、火雞、各種野生禽及觀賞鳥類等250多種不同禽類的感染[1]，引發(fā)新城疫(Newcastle disease，ND)，該病毒強毒引起的是一種高度接觸性的急性烈性傳染病，對養(yǎng)禽業(yè)影響極大。NDV基因組長度存在15 186、15 192、15 198 bp 3種[2]，前兩種均屬于ClassⅡ類，第3種屬于Class Ⅰ類。該基因組可編碼6種結構蛋白，其中F基因編碼的F蛋白(fusion protein)主要負責病毒囊膜和宿主細胞膜之間的融合[3]，是決定NDV毒力強弱的主要基因，也是NDV分子流行病學研究的首選基因。

Composing Principles of 630 Tibetan Veterinary Proved Recipes and

VeronicaciliataBased on Traditional Chinese Medicine Inheritance System

CHEN Chao-xi，HE Dong-mei，WEN Juan，TANG Cheng

(CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan,610041,China)

Abstract:To analyze the composing principles of the prescriptions of 630 Tibetan veterinary proved recipes and Veronica ciliata, unsupervised data mining method such as revised mutual information, complex system entropy cluster and unsupervised hierarchical clustering were used based on the traditional Chinese medicine inheritance system software．The results showed that the single medicine, classification, four properties, five tastes channel-tropism with a higher use frequency in 630 proved recipes were Terminalia chebula, Asteraceae, warm, bitter and liver individually; and two new prescriptions were mined from the 26 proved recipes including Veronica ciliata． A Newcastle disease virus，named duck/hunan/yy 858/14，was isolated from 14 samples of the healthy ducks in live poultry markets around Dongting Lake region. It was identified with hemagglutination test，hemagglutination inhibition test and RT-PCR. The virus F gene was amplified by RT-PCR, sequenced and analyzed by DNA Star and Lasergene software. The phylogenetic tree of F gene was constructed . The result showed that the total length of the F gene was 1 792 bp，ORF was 1 662 bp. The F gene encodes 553 amino acids. The virus named duck/hunan/yy 858/14 belong to genotype 3 of Class I virus. It′s composition of amino acid cleavage site was112ERQERL117，which was typical molecular characteristic of Newcastle disease virus. Homology analysis showed that the homology was low, 73.4% and 71.6% respectively among duck/hunan/yy 858/14, V4 and La Sota vaccine strains in ClassⅡ. The homology was high, 91.2% and 91.0% respectively among duck/hunan/yy 858/14, Chicken/HongKong/1525.16/2005 and Duck/China/08-004 /2008,there is closer genetic relationship to wild-bird Jilin strain J36/13.

Key words:Tibetan veterinary proved recipes; traditional Chinese medicine inheritance system; composition principle; Veronica ciliata duck NDV；live poultry market；isolation and identification；genetic evolution analysis

Class Ⅰ NDV廣泛存在于野生水鳥、家禽及活禽市場，早期從家鴨中分離到較多。近年來，不斷有報道稱在美洲、歐洲及中國香港等地的活禽市場中可分離到不同基因的Class Ⅰ NDV[4-6]。水禽被認為是NDV的天然存儲庫，對NDV的長期地方性流行起重要作用，野禽、水禽和家禽之間很可能存在雙向傳播現(xiàn)象[7]。湖南洞庭湖地理位置和氣候條件優(yōu)越，生態(tài)系統(tǒng)完整，是我國候鳥遷徙的主要“中轉站”，水禽的帶毒污染同樣對候鳥存在高風險，所以加強對水禽尤其是健康水禽攜帶NDV的病原學監(jiān)測，了解活禽市場水禽源NDV毒株的分子生物學特性及在流行病學中的意義，為更好地防范新城疫的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑RNA提取試劑Trizol Reagent購自Invitrogen公司；dNTP、DNA Marker和Taq DNA聚合酶購自購自寶生物工程(大連)有限公司； 質粒提取試劑盒和PCR產物回收純化試劑盒購自Qiagen公司；克隆載體pGEM -T Easy Vector和反轉錄試劑盒AMV Reverse Transcriptase kit購自Promega公司。

1.1.2樣品從湖南洞庭湖周邊3個縣市(岳陽市、常德市、益陽市)的幾個活禽市場的臨床健康家鴨體內，共采集泄殖腔棉拭子420份。

1.2方法

1.2.1引物設計與合成根據(jù)GenBank中發(fā)表的Class Ⅰ NDV-F基因核苷酸序列，設計合成特異性引物，預計擴增產物大小1 907 bp(表1)，由哈爾濱博仕生物有限公司合成。

表1　NDV-F基因擴增引物

1.2.2樣品采集與處理采集的樣品置于0.01 mol/L PBS中，加入青霉素(2 000 IU/mL)、鏈霉素(2 mg/mL)和林可霉素(50 mg/mL)，充分振蕩混勻，置于4℃過夜后離心(12 000 r/min，2 min)，取上清備用。

1.2.3病毒的分離與鑒定取處理好的樣品上清液尿囊腔接種9日齡～11日齡的SPF雞胚，3個胚/份樣品，0.2 mL/胚，37℃繼續(xù)孵育。棄去24 h內死亡雞胚，收集24 h～72 h死亡和未死亡雞胚的尿囊液。采用病毒血凝試驗(HA)檢測病毒血凝性，血凝陽性的病毒液再分別用來自哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室提供的NDV標準陽性血清、禽流感病毒(AIV)的p、p、H9標準陽性血清和EDS76標準陽性血清進行病毒血凝抑制試驗(HI)，以確定是否為NDV。然后采用雞胚有限稀釋法，用含有雙抗的PBS將分離株尿囊液作10倍倍比稀釋，取105～109稀釋梯度接種9日齡～11日齡SPF雞胚，每個稀釋梯度接種2枚，100 μL/枚。置于37℃孵化室，分24、36、48 h時段照胚，棄掉24 h內死亡雞胚，收集24 h以后的死胚和活胚，選取最高稀釋度且血凝價合適的雞胚尿囊液繼續(xù)傳代接種，如此連續(xù)3次純化后進行RT-PCR的進一步鑒定。

1.2.4病毒RNA提取、cDNA的合成及F基因擴增取以上分離純化毒株的雞胚尿囊液200 μL，按試劑盒操作說明進行病毒RNA的提取和反轉錄，得其cDNA，然后進行PCR擴增，反應條件為：95℃ 5 min,94℃ 30 s,56℃ 45 s,72℃ 1 min,進行35個循環(huán);然后72℃ 10 min,最后取6 μLPCR產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，鑒定結果。

1.2.5PCR產物的克隆轉化和序列測定將PCR產物經膠回收純化后,16℃ 3 h連接至pGEM-T Easy Vector；轉化至DH10 Bac感受態(tài)細胞,均勻涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)過夜。挑取陽性菌落(白色單個菌落)進行PCR鑒定，反應條件為：95℃ 5 min,94℃ 30 s,56℃ 45 s,72℃ 1 min,進行35個循環(huán);72℃ 10min。選取3個鑒定為陽性轉化的重組菌落送哈爾濱獸醫(yī)研究所流感病毒組進行測序。

1.2.6F基因的遺傳進化樹構建及同源性比較分析利用DNA Star軟件對所測定的NDV Cuck/hunan/yy858/14的F基因序列與從GenBank中獲取的23株已發(fā)表的Class I NDV和部分ClassⅡNDV基因進行序列分析和同源性比較，應用遺傳進化分析軟件MEGA 5.1，以Maximum likelihood方法構建NDV F基因的系統(tǒng)進化樹。

2結果

2.1病毒的分離鑒定

接種雞胚后獲取的尿囊液，測得14份具有血凝性，然后將有血凝性的尿囊液(即病毒液)進行血凝抑制試驗(HI)。結果顯示有1份病毒液的血凝性能被NDV標準陽性血清抑制而不能被AIV各亞型陽性血清及EDS76標準陽性血清抑制；此外，觀察雞胚胚體有出血和充血情況，從而初步鑒定該分離株為新城疫病毒(NDV)。

2.2F基因的擴增

經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,顯示F基因的RT-PCR擴增產物片段大小約為2 000 bp，與預期目的片段(1 907 bp)大小相符(圖1)，證實為NDV，命名為NDV duck/hunan/yy 858/14。

M.DNA標準 DL 2 000；1.病毒分離株

2.3F基因的序列和遺傳進化分析

將測得NDV duck/hunan/yy 858/14的F基因序列與從GenBank中獲取的23株已發(fā)表的Class Ⅰ NDV和部分ClassⅡ基因進行比對分析,采用MEGA5.1軟件構建F基因遺傳進化樹(圖2)。從圖可以看出,本分離株NDV duck/hunan/yy 858/14與我國內地首次分離到的Class Ⅰ 毒株NDV08-004、吉林野鳥毒株J36/13、香港活禽市場分離株Chicken/HongKong/1525.16/2005同屬于Class Ⅰ基因3型；與弱毒疫苗株V4、La Sota等屬不同分支，遺傳進化關系較遠。 序列結果表明分離株NDV Duck/hunan/yy 858/14的F基因全長為1 792 bp，ORF為1 662 bp，共編碼553個氨基酸。裂解位點的氨基酸組成為112ERQERL117，符合典型的新城疫病毒弱毒株特征，但不同于弱毒疫苗株La Sota F蛋白裂解位點的氨基酸序列112GRQGRL117。本分離株 F蛋白的第25位氨基酸為M(蛋氨酸)，

圖2　NDV F基因遺傳進化樹

與王偉偉等[8]研究總結的ClassI NDV的典型分子特征結果一致。通過對分離株的F基因蛋白的潛在糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr結構,NXS /T)分析比較發(fā)現(xiàn)：分離株6個糖基化位點分別位于第85-87(N-R-T)、191-193(N-K-T)、366-368(N-T-S)、447-449(N-I-S)、471-473(N-N-S)、541-543(N-N-T)位氨基酸，均高度保守。

核苷酸同源性分析顯示：與香港活禽市場分離到的同為Class Ⅰ基因3型毒株Chicken/HongKong/1525.16/2005的同源性為91.2%；與劉華雷首次在內地分離到的Class Ⅰ類毒株Duck/China/08-004/2008的核苷酸同源性為91.0%；與吉林野鳥毒株J36/13的核苷酸同源性為98.3%；與ClassⅡ類的弱毒疫苗株V4、La Sota的核苷酸同源性分別為73.4%和71.6%。

3討論

研究表明，新城疫病毒在其演變過程中產生了兩大分支，即ClassⅠ和ClassⅡ。Ⅰ類新城疫病毒可分為9個基因型,分別為基因1～9型；Ⅱ類新城疫病毒也可分為9個基因型,分別為基因型Ⅰ～Ⅸ型，其中基因Ⅳ型是造成新城疫第一次世界大流行的主要基因型，危害對象主要是雞，水禽和鳥類幾乎不發(fā)??；基因V型是造成第2次大流行的主要基因型，始于中東的鸚鵡國際貿易，危害對象主要是觀賞鳥及禽類；由鴿子引起的第3次大流行的主要基因型是Ⅵ型；基因Ⅶ型則是造成20世紀90年代以來在亞洲、歐洲和非洲等地區(qū)引起第4次大流行的基因型，此次的流行開始對水禽的危害增大，且基因Ⅶ型的毒株已初步演變?yōu)閍、b、c、d、e、f等若干亞型[9]。Class I NDV大多從野生水禽及家養(yǎng)水禽中分離，被認為是一種廣泛存在于水禽體內且不致病的NDV[10-11]，近年來就有報道美國、香港以及我國內地從活禽市場中分離到ClassⅠNDV, 且這些病毒與當?shù)厮褂玫囊呙缰瓴煌?。本分離株NDV Duck/hunan/yy858/14與香港活禽市場分離株Chicken/HongKong/1525.16/2005、劉華雷首次在內地分離到的NDV毒株Duck/China/08-004/2008同為ClassⅠ基因3型，且它們之間的同源性都在90%以上，但已出現(xiàn)在了不同的小分支上，說明隨著時間的推移，已存在一定程度的變異；又因為與廣泛使用的NDV弱毒疫苗株LaSota遺傳距離較遠,說明分離株不是來自疫苗的散毒；與吉林野鳥毒株J36/13的親緣關系更近，核苷酸同源性為98%以上，推測兩者有共同的毒株來源。

我國目前的活禽市場監(jiān)測到的多數(shù)為健康禽類帶弱毒，有試驗表明，Class Ⅰ NDV的高感染或帶毒，雖然一定程度上有利于提高禽群對新城疫的免疫保護，但卻加大了新城疫病毒毒株間相互影響和作用，增加了病毒變異的幾率[12-13]。曾有報道這種Ⅰ類新城疫病毒一旦通過水禽傳播到易感的陸生家禽如雞中,則毒力發(fā)生返強的可能大大增加[14]，目前就存在有1例實驗室返強毒株[15]，證實了Class Ⅰ弱毒株返強的可能性。

以前，人們更加關注致病性毒株的研究而忽視了對低致病性毒株的檢測及毒力演變等相關性的研究，導致這種弱毒株在家禽-水禽-野禽中的循環(huán)，從而存在演變成強毒株的危險?；钋菔袌鍪且粋€人為的小生態(tài)環(huán)境，其中有家禽、水禽、各種鳥類以及被捕捉的野禽交易，環(huán)境的惡劣程度加強，迎合了新城疫病毒變異速度快的特征，加快了新城疫病毒的進化，加大了產生新基因型的可能，所以從活禽市場來探究新城疫病毒的溯源、流行和進化，對于新城疫病毒的未來研究及防制措施的制定具有重要意義。

參考文獻：

[1]王志亮，劉華雷.新城疫[M].北京：中國農業(yè)出版社，2012.

[2]Czegledi A, Ujvari D, Somogyi E, et al. Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1 (Newcastle disease virus) and evolutionary implications [J]. Virus Res, 2006, 120(1-2): 36-48

[3]金仕強，孟春春，于圣青，等. ClassⅠ新城疫病毒概述[J].動物醫(yī)學進展, 2012,33(4):102-106.

[4]Lee E K, Jeon W J, Kwon J H, et al. Molecular epidemiological investigation of Newcastle disease virus from domestic ducks in Korea[J]. Vet Microbiol, 2009, 134(3-4): 241-248.

[5]Tsunekuni R, Ito H. Genetic comparisons between lentogenic Newcastle disease virus isolated from waterfowl and velogenic variants [J]. Virus Genes, 2010, 40(2): 252-255.

[6]Liu X, Wang X, Wu S, et al. Surveillance for avirulent Newcastle disease viruses in domestic ducks(AnasplatyrhynchosandCairinamoschata)at live bird markets in Eastern China and characterization of the viruses isolated[J]. Avian Pathol, 2009, 38(5): 377-391.

[7]Diel D G, da Silva L H, Liu H, et al. Genetic diversity of avian paramyxovirus type 1: Proposal for a unified nomenclature and classification system of Newcastle disease virus genotypes[J]. Infect Genet Evol, 2012(12): 1770-1779.

[8]王偉偉. 江蘇省新城疫病毒分子流行病學研究及鴿源分離株基因組序列的分析[D]. 江蘇揚州: 揚州大學, 2009.

[9]Kim L M, King D J, Curry P E, et al. Phylogenetic diversity among low-virulence Newcastle disease viruses from waterfowl and shorebirds and comparison of genotype distributions to those of poultry-origin isolates[J]. J Virol, 2007, 81(22):12641-12653.

[10]Kim L M, King D J, Suarez D L, et al. Characterization of class I Newcastle disease virus isolates from Hong Kong live bird markets and detection using real-time reverse transcription PCR[J].J Clin Microbiol，2007, 45(4):1310-1314.

[11]Kim L M, King D J, Curry P E, et al. Phylogenetic diversity among low-virulence Newcastle disease viruses from waterfowl and shorebirds and comparison of genotype distributions to those of poultry-origin isolates[J].J Virol, 2007,81(22):12641-12653.

[12]Fentie T, Heidari A, Aiello R, et al. Molecular characterization of Newcastle disease viruses isolated from rural chicken in northwest Ethiopia reveals the circulation of three distinct genotypes in the country[J].Tropical Animal Health Production, 2014,46(2):299-304.

[13]Hua Y P, Chai H L. Primary survey of avian influenza virus and Newcastle disease virus infection in wild birds in some areas of Heilongjiang Province [J]. China J Vet Sci,2005, 6 (4): 311-315.

[14]Lee E K, Jeon W J. Molecular epidemiological investigation of Newcastle disease virus from domestic ducks in Korea[J]. Vet Microbiol, 2008, 134(3): 241-248.

[15]于圣青，丁鏟，Kishida N,等. 新城疫病毒某水禽分離株經雞體傳代后由非致病型轉變?yōu)樗侔l(fā)型的研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2003，25(1)：59-64.

Isolation,Identification and Genetic Evolution Analysis of Duck NDV

動物醫(yī)學進展,2015,36(11):69-73ProgressinVeterinaryMedicine

in Live Poultry Markets Around Dongting Lake Region

GUO Wei1, HU Shi-feng1, WANG Wei-guo2, HE Shi-cheng2, TANG Xiao-ming2,

LIN Yuan2, LU Xing-hua2, WANG Chang-jian2

(1.CollegeofVeterinaryMedicineofHunanAgriculturalUniversity，Changsha,Hunan,410128,China；

2.AnimalDiseasePreventionandControlCenterofHunan，Changsha,Hunan,410019,China)

通訊作者

作者簡介：郭威(1989-)，男，湖南常德人，碩士研究生，主要從事畜禽疾病的防控。*

收稿日期：2015-05-12

文章編號:1007-5038(2015)11-0069-05

中圖分類號:S852.659.5

文獻標識碼:A