侯衍豹 楊勇，2 容蓉 孫啟慧 蔣海強(qiáng) 李榮榮

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355；2.山東省經(jīng)方研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250355）

偏最小二乘法（PLS）建模分析麻黃細(xì)辛附子湯對腎陽虛外感小鼠的干預(yù)作用

侯衍豹1楊勇1，2容蓉1孫啟慧1蔣海強(qiáng)1李榮榮1

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355；2.山東省經(jīng)方研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250355）

目的：采用偏最小二乘法（PLS）整體判斷麻黃細(xì)辛附子湯對腎陽虛小鼠外感模型的干預(yù)作用。方法：KM雄性小鼠91只隨機(jī)分空白對照組、模型組、利巴韋林組、連花清瘟組和麻黃細(xì)辛附子湯（MXF）低、中、高、劑量組。除空白對照組外其余各組小鼠采用腹腔注射苯甲酸雌二醇（8mg/kg）法復(fù)制腎陽虛小鼠模型，采用流感病毒FM1尿囊液（血凝滴度為1：320）滴鼻感染小鼠，建立腎陽虛小鼠外感模型。感染1d后各組分別給藥，每日1次，共6d。觀察各組小鼠的體重、肛溫變化。采用SIMCA-P軟件處理小鼠的體重、肛溫、各臟器指數(shù)、死亡率等指標(biāo)，應(yīng)用偏最小二乘法通過整體評價(jià)，綜合判斷造模情況及不同藥物的干預(yù)效果。結(jié)果：PLS分析處理表明，與空白對照組比較，模型組綜合藥效分值顯著較低（P＜0.01）；各給藥組綜合藥效分值與模型組比較都有顯著性差異（P＜0.01），各給藥組都表現(xiàn)出了一定的治療效果，其中麻黃細(xì)辛附子湯中劑量效果更佳。結(jié)論：采用PLS分析方法對腎陽虛外感模型及各組藥物干預(yù)進(jìn)行綜合評價(jià)，能較好地反映證候及中藥復(fù)方整體調(diào)控作用的特點(diǎn)，避免某一個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)評價(jià)容易引起片面結(jié)論的弊端。

麻黃細(xì)辛附子湯 流行性感冒 腎陽虛 數(shù)學(xué)建模 綜合藥效評價(jià) 臟器指數(shù) KM小白鼠 實(shí)驗(yàn)研究

流行性感冒是由流感病毒引起的上呼吸道病毒感染性疾病，發(fā)病率高，潛伏期短，易暴發(fā)流行，是人類最常見的上呼吸道感染性疾病之一［1］。我國傳統(tǒng)治療感冒的中成藥對流感引起的癥狀療效好，且能標(biāo)本兼治，毒副作用相對較小。流感的高發(fā)病人群多屬于中醫(yī)學(xué)腎陽虛者［2］，對于此類人群服用單純治療流感的藥物是否見效及效果如何尚不明確，偏最小二乘法（PLS）目前是一種較先進(jìn)的多元分析方法，主要用于解決化學(xué)樣本分析中存在的變量多重相關(guān)，以及解釋變量多于樣本點(diǎn)等實(shí)際問題，能夠解決許多普通多元回歸方法無法解決的問題，其應(yīng)用不斷擴(kuò)展，涉及化學(xué)、機(jī)械、生物、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)等領(lǐng)域［3］。本實(shí)驗(yàn)選用目前在季節(jié)性流感治療中主流的中成藥之一連花清瘟膠囊，和西藥利巴韋林作為陽性對照藥，以《傷寒論》中所記載的治療少陰病兼表證（及腎陽虛外感）的經(jīng)方麻黃細(xì)辛附子湯作為受試藥，來比較它們對腎陽虛外感的治療效果差異，并采用SIMCA-P軟件的偏最小二乘法（PLS）回歸進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)建模分析，避免選用某一個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)評價(jià)易引起片面結(jié)論的弊端，目的是通過PLS分析方法對藥理模型及藥物干預(yù)進(jìn)行綜合評價(jià)為中醫(yī)臨床上辨證選方、辨病用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物KM小白鼠，雄性，體重（20±2）g，SPF級，由山東魯抗動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物許可證號：SCXK（魯）20080002。

1.2 試劑與藥物苯甲酸雌二醇，寧波第二激素廠，批號140627；流感病毒甲型（FluA，北京地方株引自中國CDC病毒病研究所）；利巴韋林顆粒，四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號131210；麻黃、炮附子、細(xì)辛，濟(jì)南市建聯(lián)中藥有限公司中藥飲片廠，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定符合《中國藥典》2010年版標(biāo)準(zhǔn)；連花清瘟膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號130144）。

1.3 儀器智能恒溫控制儀（成都泰盟科技有限公司），DT-880B型手持式人體表面溫度快速篩檢儀（深圳市華盛昌機(jī)械實(shí)業(yè)有限公司），ZIL-2型小鼠自主活動儀（北京醫(yī)科院藥研所），01193-YP601N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組小鼠按體重和肛溫隨機(jī)分成腎陽虛外感組（模型組）、利巴韋林組、連花清瘟組、麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組，并設(shè)空白對照組。

2.2 造模與給藥

2.2.1 腎陽虛模型參考文獻(xiàn)［4］的方法并改進(jìn)造模劑量，20mL/kg腹腔注射0.4mg/mL苯甲酸雌二醇稀釋液，每日1次，連續(xù)15d，復(fù)制腎陽虛模型。空白對照組小鼠腹腔注射生理鹽水20mL/kg。于造模12～13d進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測，通過測定自主活動、肛溫、趾溫、游泳時(shí)間［2］，以判定模型成功與否。

2.2.2 腎陽虛外感模型將復(fù)制成功的腎陽虛模型小鼠用流感病毒FM1雞胚尿囊液（血凝滴度為1∶320）50μL/只滴鼻感染，空白對照組小鼠滴鼻接種等量生理鹽水。

2.2.3 給藥第0日為接種病毒前，第1日接種流感病毒，2～7d為藥物干預(yù)治療。小鼠灌胃量為10mL/kg，利巴韋林組予0.0625g/kg利巴韋林，麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組分別予2.5、12.5、25g/kg麻黃細(xì)辛附子湯，連花清瘟組予0.525g/kg蓮花清瘟膠囊，空白對照組、模型組灌服蒸餾水，每日1次，連續(xù)給藥6d。

2.3 觀察指標(biāo)每日測量接種流感病毒后小鼠的體溫、體重1次，記錄變化趨勢，并觀察過程中小鼠的臨床癥狀如精神狀況、活動度、飲食等變化，并記錄過程中每組動物的死亡數(shù)目。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取各組小鼠肺、脾、胸腺等組織，稱取臟器重量，計(jì)算臟器指數(shù)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法單因素方差分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。偏最小二乘法分析：采用SIMCA-P軟件的偏最小二乘法（PLS）對各組綜合藥效學(xué)進(jìn)行評價(jià)分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠體重變化空白對照組小鼠體重明顯增長；從接種流感病毒起，腎陽虛外感模型組小鼠體重呈持續(xù)降低趨勢直到第7日未見恢復(fù)，造模第2日起體重與空白對照組小鼠比較，有顯著性差異（P＜0.01）；利巴韋林組小鼠體重雖開始呈降低的趨勢，但之后逐漸恢復(fù)，藥物干預(yù)第3日起已明顯高于模型組（P＜0.05）；麻黃細(xì)辛附子湯不同劑量組小鼠體重呈明顯上升趨勢，自干預(yù)第3日起明顯高于模型組（P＜0.05），干預(yù)第4日起與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

3.2 各組小鼠肛溫變化從接種病毒到第5日空白對照組小鼠肛溫明顯高于其他組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；接種病毒第1～5日模型組小鼠肛溫較空白對照組顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物治療組小鼠肛溫于接種病毒第4日起明顯升高（P＜0.05），麻黃細(xì)辛附子湯各劑量組相對于其他給藥組有升高的趨勢但無顯著性差異（P＞0.05）。見圖2。

圖1 各組小鼠體重變化比較

圖2 各組小鼠肛溫變化比較

3.3 各組小鼠死亡率、肺指數(shù)比較與模型組比較，各組藥物均有不同程度降低小鼠死亡率的作用，而麻黃細(xì)辛附子湯中、高劑量能夠顯著性降低腎陽虛外感小鼠的死亡率。與空白對照組比較，模型組小鼠肺指數(shù)明顯增大（P＜0.01），與文獻(xiàn)報(bào)道一致［5-6］；與模型組比較，各給藥組小鼠肺指數(shù)明顯降低（P＜0.05），表明經(jīng)藥物干預(yù)后肺感染程度明顯改善。見表1。

表1 各組小鼠死亡率、肺指數(shù)比較

3.4 采用PLS對各組綜合藥效學(xué)進(jìn)行評價(jià)分析

3.4.1 對本實(shí)驗(yàn)7個(gè)組原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理自變量表見表2。

表2 腎陽虛外感模型指標(biāo)變量標(biāo)識表

3.4.2 得分圖及VIP變量投影重要性指標(biāo)綜合藥效得分圖見圖3。變量投影重要性指標(biāo)用來描述自變量對因變量的解釋能力，VIP值越大，自變量x對y的解釋能力越強(qiáng)。用VIP值大于1的變量建立藥物對腎陽虛外感干預(yù)作用PLS回歸模型。y=0.148X23-0.11X25+0.165X9+0.159X10-0.029X17+ 0.156X11+0.15X12+0.025X27+0.025X28+0.025X29+ 0.025X30-0.015X16-0.016X4。見圖4。各組小鼠綜合藥效分值比較見圖5。

圖3 各組小鼠綜合藥效得分圖

從結(jié)果可以看出，各給藥組綜合藥效分值與模型組比較都有顯著性差異（P＜0.01）。與空白對照組相比模型組綜合藥效分值顯著較低（P＜0.01），根據(jù)得分圖可以看出空白對照組、模型組能顯著分開，說明腎陽虛外感模型的制備可行，反映出明顯的病理損傷狀態(tài)。給藥組相對于模型組都表現(xiàn)出了一定的治療效果，根據(jù)各給藥組綜合藥效分值比較圖可以看出綜合藥效分值平均數(shù)越接近空白對照組、遠(yuǎn)離模型組綜合藥效學(xué)效果越顯著，麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量都表現(xiàn)出了良好的藥效效果，其中麻黃細(xì)辛附子湯中劑量尤佳。

圖4 陽虛外感模型VIP直方圖

圖5 各組小鼠綜合藥效分值比較圖（±s）

4 討論

本研究采用連花清瘟膠囊作為中藥對照藥，考慮原因有二：其一，治療外感疾病，連花清瘟膠囊作為復(fù)方中藥，具有多成分、多靶點(diǎn)的中藥作用特點(diǎn)，且研究發(fā)現(xiàn)，“對于甲型H1N1流感，連花清瘟在縮短病程和減少病毒載量上與奧司他韋療效相似，可作為治療H1N1病毒感染的另一有效藥物，連花清瘟膠囊可以顯著改善病毒性肺炎小鼠的癥狀和存活率，可降低細(xì)胞因子表達(dá)水平，從而改善肺部炎癥［7］。其二，連花清瘟膠囊可“用于治療流行性感冒屬熱毒襲肺證”，與本研究的腎陽虛外感證還是具有較大的區(qū)別，所以運(yùn)用連花清瘟膠囊和麻黃細(xì)辛附子湯分別干預(yù)腎陽虛外感小鼠模型，它們的作用差別也從另一個(gè)角度反映出“方證相應(yīng)”的必要性，本研究的綜合藥效評價(jià)也反映出這點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，模型組動物由于接種了流感病毒出現(xiàn)了肺部水腫、充血、炎癥等癥狀，導(dǎo)致肺指數(shù)相對于空白對照組升高并出現(xiàn)了較高的死亡率，各給藥組都有降低肺指數(shù)及死亡率的趨勢，說明各給藥組都有改善肺部炎癥提高小鼠存活率的效果。模型組動物為腎陽虛體征，其機(jī)體免疫功能下降，脾、胸腺、腎上腺作為體內(nèi)重要的免疫器官，其臟器指數(shù)呈降低趨勢。本研究綜合中醫(yī)的證模型（腎陽虛）和西醫(yī)的致病因素（流感病毒FM1鼻腔滴注感染），建立了病證結(jié)合的腎陽虛外感模型，通過整體的外觀狀況、生理狀態(tài)、自主活動、被動負(fù)重游泳等指標(biāo)，結(jié)合趾溫、肛溫動態(tài)監(jiān)測，感染病毒后死亡率比較，肺組織病理改變綜合評價(jià)，較好地模擬了臨床腎陽虛外感的病證狀態(tài)。

動物的動態(tài)生理指標(biāo)雖然比較簡單，但能直接和準(zhǔn)確地反映機(jī)體健康狀態(tài)，再結(jié)合肺指數(shù)、死亡率等客觀的金指標(biāo)能快速地判斷出模型的狀態(tài)及藥物干預(yù)的大體效果；另外，這種整體動態(tài)的生理、病理指標(biāo)評價(jià)也較符合中醫(yī)“證候”的特點(diǎn)（動態(tài)的、疾病階段性的、外觀癥狀為主的描述表征）。但目前有關(guān)中醫(yī)證候、中藥復(fù)方的藥效評價(jià)常局限于某個(gè)指標(biāo)或某幾個(gè)指標(biāo)的判斷，有時(shí)會根據(jù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)或部分有顯著性差異的結(jié)果來判斷，容易導(dǎo)致以偏概全或片面的結(jié)論。我們采用的PLS統(tǒng)計(jì)分析，目的是將相關(guān)的藥效指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后采用數(shù)學(xué)建模，綜合起來進(jìn)行比較分析（類似于綜合測評模式），可更客觀地評價(jià)復(fù)合病證動物模型及中藥復(fù)方的整體療效。

本實(shí)驗(yàn)使用SIMCA-P軟件中的PLS來處理藥理學(xué)數(shù)據(jù)，通過得分圖可以看出空白對照組及腎陽虛外感組在二維圖上區(qū)分很明顯，說明腎陽虛外感模型制備較好。VIP圖中可以看出死亡率、肛溫、肺指數(shù)等指標(biāo)對綜合藥效結(jié)果的影響是最大的，這與藥理學(xué)分析判斷方法一致。各給藥組綜合藥效得分及比較圖可以看出麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組相對于其他給藥組表現(xiàn)出了更好的治療效果，其中麻黃細(xì)辛附子湯中劑量組治療效果尤佳。中劑量相當(dāng)于臨床的等效劑量，這也提示麻黃細(xì)辛附子湯使用時(shí)要注意選擇合適的劑量范圍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用PLS來分析處理藥理學(xué)數(shù)據(jù)簡便可靠，能較好地反映證候特征及中藥復(fù)方的整體調(diào)控作用，避免某一個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)評價(jià)容易引起片面結(jié)論的弊端，為中醫(yī)臨床上辨證選方、辨病用藥提供了更客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］李世宏，梁紀(jì)蘭，楊銳樂，等.中藥抗流感病毒研究進(jìn)展.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2007，26（5）：26

［2］楊勇.腎陽虛外感小鼠模型建立及麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)研究.濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2012

［3］王惠文，吳載斌.偏最小二乘回歸的線性與非線性方法.北京：國防工業(yè)出版社，2006：9

［4］陳素紅，呂圭源，范景，等.海馬不同提取物對雌二醇致腎陽虛小鼠的影響.中草藥，2009（2）：258

［5］劉培民，張鴻彩，包培蓉．升降散抗流感病毒實(shí)驗(yàn)研究．山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，25（1）：43

［6］閆懷士，李京培．艾灸抗小鼠流感病毒性肺炎的實(shí)驗(yàn)研究.上海針灸雜志，2006，25（7）：43

［7］鐘南山.從SARS到H7N9——中醫(yī)藥治療的啟發(fā).第十屆國際絡(luò)病學(xué)大會會議報(bào)告

R511.605

A

1672-397X（2015）11-0079-04

侯衍豹（1990—），男，碩士研究生，從事中藥及復(fù)方藥理和毒理研究。595044561@qq.com

楊勇，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。yy7204@163.com

2015-06-08

編輯：吳寧

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273626）；國家科技重大專項(xiàng)（2014ZX09509001-001）；山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目（XTCX2014B-02）；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃（2013-026）；山東省教育廳科技發(fā)展計(jì)劃（J10LF20）