周濤，陳長(zhǎng)寶*，周杰，游桂榮

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018

2.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016

3，3＇-二氯聯(lián)苯胺分子印跡整體柱的識(shí)別性能研究

周濤1，陳長(zhǎng)寶1*，周杰1，游桂榮2

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018

2.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016

以3，3＇-二氯聯(lián)苯胺為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體為致孔劑，乙腈和氯仿混合溶液為溶劑，合成了3，3＇-二氯聯(lián)苯胺分子印跡整體柱?？疾炝?，3＇-二氯聯(lián)苯胺分子印跡整體聚合物的結(jié)合性質(zhì)及其在3，3＇-二氯聯(lián)苯胺分子聚合物上的選擇性分離富集特性。得到的分子印跡聚合物整體柱，對(duì)模板分子具有特異的識(shí)別能力，在所選擇的色譜條件下，3，3＇-二氯聯(lián)苯胺與類似物可以得到較好的分離。

分子印跡；3，3＇-二氯聯(lián)苯胺；高效液相色譜；整體柱

分子印跡技術(shù)（Molecular Imprinting Technology，MIT）［1，2］是指制備對(duì)某一特定的目標(biāo)分子（模板分子、印跡分子或烙印分子）具有特異選擇性的聚合物的過(guò)程。它可以被形象地描繪為制造識(shí)別分子鑰匙［3］的人工鎖技術(shù)，由于這種印跡聚合物對(duì)印跡分子具有專一識(shí)別性，而且具有穩(wěn)定性好、使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因而倍受人們的關(guān)注。

多氯聯(lián)苯（Polychlorinated biphenyls，PCBs）［4-6］是一類人工合成的廣泛存在于生物圈的持久性有機(jī)污染物（Persistent organic pollutants，POPs），其分子結(jié)構(gòu)為聯(lián)苯苯環(huán)上的氫原子被氯原子取代而形成。3，3＇-二氯聯(lián)苯胺（3，3＇-dichlorobenzidine，DCB）是生產(chǎn)聯(lián)苯胺黃和永固橘黃等不可替代的原料。DCB是動(dòng)物致癌物質(zhì)，可誘導(dǎo)大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠及狗等多種動(dòng)物發(fā)生腫瘤［7］，對(duì)人為可疑致癌物。對(duì)環(huán)境有危害，對(duì)水體可造成污染。DCB作為永久性有機(jī)污染物，易揮發(fā)性使得其污染途徑及危害成為關(guān)注的焦點(diǎn)。因此，明確DCB的環(huán)境行為，準(zhǔn)確檢測(cè)環(huán)境中DCB的殘留，對(duì)消除其危害極為重要。

目前，常用的DCB檢測(cè)方法有紫外分光光度法［8］、高效液相色譜法［9］。但這些方法前處理過(guò)程復(fù)雜，且成本較高。分子印跡聚合物（MIP）整體柱制備方法簡(jiǎn)單，選擇性好且成本低，在色譜分離、固相萃取等方面得到了廣泛的應(yīng)用［10］。用原位聚合法制備分子印跡整體柱已有許多報(bào)道，但這些報(bào)道多數(shù)使用有機(jī)溶劑作為致孔劑，對(duì)強(qiáng)極性有機(jī)化合物的識(shí)別受到一定限制［11］。

室溫離子液體一般是由含氮、磷的有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)陰離子組成的在室溫時(shí)呈液態(tài)的液體。通過(guò)改變陰陽(yáng)離子組成，可以合成不同性質(zhì)的離子液體，因此離子液體又是一種新型的可設(shè)計(jì)的綠色溶劑。離子液體具有特殊物理化學(xué)性質(zhì)，與傳統(tǒng)的揮發(fā)性有機(jī)溶劑相比具有一系列突出的優(yōu)點(diǎn)：（1）超低蒸汽壓、不揮發(fā)、不易燃、無(wú)色、無(wú)臭、毒性小不易爆炸；（2）較大的穩(wěn)定溫度范圍、較好的化學(xué)穩(wěn)定性；（3）較寬的電化學(xué)穩(wěn)定電位窗；（4）可溶解無(wú)機(jī)、有機(jī)、有機(jī)金屬、合成或天然高分子材料等物質(zhì)；（5）絕大多數(shù)離子液體常壓下密度比水大；（6）粘度比一般有機(jī)溶劑或水的粘度高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，但仍具有良好的流動(dòng)性；（7）表面張力比一般有機(jī)溶劑高、比水低，使用時(shí)可以加速相分離的過(guò)程。本研究選用離子液體為致孔劑可克服上述的缺點(diǎn)，制備了DCB的分子印跡整體柱對(duì)模板分子DCB表現(xiàn)為較高的選擇性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Nicolet-380型傅立葉變換紅外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司，KBr壓片）；UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津）；H-800型電子顯微鏡（日本日立公司）；DZF-3型真空干燥箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）1810-B型石英自動(dòng)雙重純水蒸餾器（江蘇金壇中大儀器廠）；AUY120型分析天平（日本島津）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；KQ-50B型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TB-85型超級(jí)恒溫水?。ㄈ毡緧u津）；SHZ-82氣浴恒溫振動(dòng)器（金坊市精達(dá)儀器制造廠）；LC-20AT高效液相色譜（日本島津）；色譜柱：150 mm×4.6 mm I.D.

3，3＇-二氯聯(lián)苯胺鹽酸鹽（DCB，98%），氯仿（分析純），甲基丙烯酸（MAA，分析純），購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；無(wú)水乙醇（分析純），乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），冰乙酸（分析純）購(gòu)自天津永大化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純），購(gòu)自天津大陸化學(xué)試劑廠；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸（分析純），購(gòu)自河南利華制藥有限公司；濃鹽酸（36%）購(gòu)自煙臺(tái)雙雙化工有限公司；二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA，98%）購(gòu)自百威靈化學(xué)技術(shù)有限公司；偶氮二異丁腈（AIBN，化學(xué)純）購(gòu)自南開(kāi)大學(xué)特種化學(xué)試劑試驗(yàn)廠，用甲醇重結(jié)晶后使用；實(shí)驗(yàn)中EGDMA，MAA均蒸餾除去阻聚劑后使用；實(shí)驗(yàn)用水均為重蒸水。

1.2 模板分子DCB的制備

由DCB鹽酸鹽制備模板分子DCB：將11.260 g（0.044 moL）DCB鹽酸鹽加入100 mL三口瓶?jī)?nèi)，再加入10%的鹽酸15 mL及50%的乙醇水溶液15 mL邊攪拌邊升溫，待其全部溶解后冷卻至20oC，在攪拌下逐漸滴加30%的氫氧化鈉溶液至pH=8～10，這時(shí)有大量結(jié)晶析出。冷卻后抽濾、干燥，再進(jìn)行重結(jié)晶得淺黃色針狀分子化合物DCB。

1.3 DCB分子印跡聚合物

1.3.1 本體聚合法制備DCB分子印跡聚合物將0.5063 g（2 mmoL）模板分子DCB，0.680 mL（8 mmoL）功能單體MAA和2.5 mL乙腈、12.5 mL氯仿加入到30 mL的磨口錐形瓶中，通氮?dú)?0 min，密封，于0oC冰水浴中避光靜置6 h，使模板分子與功能單體充分作用后，加入7.540 mL（40 mmoL）EGDMA，離子液體BMIM+PF6-2.6 mL，30 mg AIBN，超聲溶解至溶液澄清透明，將上述溶液裝入安瓿瓶中，通氮?dú)?0 min，密封，與60oC水浴中反應(yīng)12 h，得到棒狀固體。將固體在研缽中磨碎，過(guò)篩，收集200～400目的聚合物顆粒，放入索提取器中，用乙腈/乙酸（體積比為9：1）連續(xù)抽提，除去模板分子后，再用乙腈洗至中性，抽濾后置55oC真空干燥箱中干燥至恒重，得到不規(guī)則粒狀的MIP。

相對(duì)應(yīng)的非印跡聚合物NIP的制備：除不加模板分子外，其余步驟同上。

1.3.2 印跡聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)研究準(zhǔn)確稱取模板聚合物50 mg于磨口錐形瓶中，加入5.0 mL二氯聯(lián)苯胺乙腈溶液，放入振蕩器中于29oC振蕩，每隔1 h取吸附液樣品于離心試管中，離心后取一定量的離心液，稀釋后用紫外分光光度計(jì)于287 nm進(jìn)行光度分析，測(cè)定二氯聯(lián)苯胺在乙腈中的平衡濃度，根據(jù)吸附前后二氯聯(lián)苯胺濃度的變化，可計(jì)算吸附量。吸附底物后的模板聚合物按照除去模板分子的方法洗去底物，干燥后可重復(fù)使用（平行3次）。

1.3.3 聚合物的吸附等溫線準(zhǔn)確稱取模板或非模板聚合物50 mg于磨口錐形瓶中，加入5.0 mL二氯聯(lián)苯胺乙腈溶液，放入振蕩器中于25oC振蕩24 h，然后取吸附液樣品于離心試管中，離心后取一定量的離心液，稀釋后用紫外分光光度計(jì)于287 nm進(jìn)行光度分析，測(cè)定二氯聯(lián)苯胺在乙腈中的平衡濃度，根據(jù)吸附前后二氯聯(lián)苯胺濃度的變化，可計(jì)算吸附量。吸附底物后的模板聚合物按照除去模板分子的方法洗去底物，干燥后可重復(fù)使用（平行3次）。

1.4 DCB分子印跡整體柱的制備

采用原位聚合法制備DCB分子印跡整體柱。其制備方法如下：將0.1519 g（0.6 mmoL）模板分子DCB 0.204 mL（2.4 mmoL）功能單體MAA和0.75 mL乙腈、3.75 mL氯仿加入到30 mL的磨口錐形瓶中，通氮?dú)?0 min，密封，于0oC冰水浴中避光靜止6 h，使模板分子與功能單體充分作用后，加入2.262 mL（12 mmoL）EGDMA，離子液體BMIM+PF6-0.78 mL，10 mg AIBN，超聲溶解至溶液澄清透明超聲脫氣20 min，，將上述溶液立即轉(zhuǎn)至色譜柱中（150 mm×4.6 mm），并將兩端密封，在60oC的溫度下反應(yīng)12 h，更換柱頭后將其接到HPLC泵上，用乙腈/乙酸（體積比9：1）溶液充分沖洗直至基線水平，得到DCB分子印跡整體柱。

相對(duì)應(yīng)的非印跡整體柱的制備：除不加模板分子外，其余步驟同上。

1.4.1 整體柱的表面結(jié)構(gòu)觀察將合成好的整體柱壓出柱管；用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)其進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)掃描。

1.4.2 色譜實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取一定量的聯(lián)苯胺、鄰苯二胺、對(duì)氯苯胺、二苯胺、4-乙酰氨基酚和DCB用甲醇溶解，配制成50 μg/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。以體積比7：3甲醇/水混合液為流動(dòng)相評(píng)估印跡整體柱的識(shí)別性能。流動(dòng)相流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為287 nm，所有的色譜實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 整體柱的表面結(jié)構(gòu)觀察

圖1 非印跡和印跡整體柱橫截面的掃描電子顯微鏡圖Fig.1 The scanning electron microscope（SEM）images of DCB imprinted monolithic colum（B），（C）and non-imprinted monolithic column（A）

用掃描電鏡（SEM）對(duì)用離子液體做致孔劑合成的非印跡整體柱、印跡整體柱及未加離子液體制備合成的印跡整體柱的表面形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征（見(jiàn)圖1）。從圖1可以看出，用離子液體制備的印跡整體柱B及非印跡整體柱A的粒徑均在0.1～0.3 μm范圍內(nèi)，孔隙分布均勻，而不加離子液體制備的印跡整體柱C顆粒跟孔徑明顯小于同條件下離子液體作致孔劑制備的整體柱A與B由此可以看出離子液體作致孔劑制備的整體柱孔道多增大聚合物的比表面積，相較于不加離子液體作致孔劑的整體柱有良好的通透性；印跡整體柱B相對(duì)于非印跡整體柱A粒狀明顯，孔道多，包裹在網(wǎng)絡(luò)骨架中具有良好分布的微孔通道，保證了印跡柱的高滲透性和快的傳質(zhì)速率，原因可能是在制備過(guò)程中，模板分子在聚合物母體中占有一定的空間和體積，被洗脫后，這種空間和體積被固定下來(lái)，從而增大了聚合物的比表面積，為印跡聚合物對(duì)模板分子的選擇性識(shí)別提供了良好的通透性。因此可以推斷印跡整體柱對(duì)模板分子DCB有一定的選擇性吸附作用。

目前已有將離子液體作為分子印跡聚合物合成的溶劑和致孔劑的報(bào)道，也有研究表明離子液體的存在可加速聚合過(guò)程，提高特異識(shí)別能力和結(jié)合量［13-16］。

2.2 印跡聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)研究

圖2為DCB印跡聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。由圖2可見(jiàn)，聚合物在前4 h內(nèi)對(duì)DCB吸附量迅速增大，由此后緩慢增加，5 h飽和吸附量趨于穩(wěn)定，說(shuō)明聚合物孔穴能吸附模板分子達(dá)到平衡。

2.3 聚合物的等溫吸附曲線分析

圖2 DCB印跡聚合物吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Adsorption kinetics curveofDCBonthe molecularly imprinted polymer

圖3 DCB在印跡聚合物和非印跡聚合物上的吸附等溫線Fig.3Adsorption isotherms of DCB on the MIPand NIP

由圖3可見(jiàn)，在25oC在一定濃度范圍內(nèi)，印跡與非印跡聚合物對(duì)DCB的吸附量均隨DCB濃度的增大而增大，但是印跡聚合物的吸附量均明顯的大于非印跡聚合物，且二者的吸附量之差隨溶液濃度的增加而增大。說(shuō)明組成相同的兩種聚合物的空間結(jié)構(gòu)存在明顯的差異。其原因是MIP包含有固定排列的功能基的空間空穴，其大小和固定排列的功能基與模板分子DCB互補(bǔ)，這種空穴對(duì)DCB分子呈現(xiàn)“記憶功能”。兩種聚合物的吸附量的差值主要來(lái)源于這種空穴的選擇性吸附。這是MIP突出的結(jié)構(gòu)特征。超過(guò)一定濃度范圍印跡聚合的吸附量不隨濃度的增加而增加，說(shuō)明印跡聚合物的吸附量已達(dá)到飽和。

2.4 印跡聚合物的Scatchard分析

分子印跡聚合物研究工作中常用Scatchard模型來(lái)評(píng)價(jià)聚合物結(jié)合特性［26］，本文將印跡聚合物結(jié)合等溫吸附曲線獲得的結(jié)果進(jìn)行Scatchard分析，來(lái)考察所制得的DCB-MIP對(duì)DCB的結(jié)合機(jī)理。

Scatchard方程如公式（1）：

其中，Q為DCB在DCB-MIP上的平衡結(jié)合容量（mmoL/g），Ce為模板分子在吸附液中的平衡濃度（mmoL/L），Qmax為結(jié)合位點(diǎn)的表觀最大結(jié)合常數(shù)（mmoL/g），Kd為結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)（mmoL/L）。圖4是MIP在乙腈溶液中對(duì)DCB吸附特征的Scatchard曲線。由圖4可以看出，Q/Ce-Q曲線明顯呈線性關(guān)系，這表明印跡聚合物存在一類等價(jià)的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)DCB呈現(xiàn)均勻的親和力，這種結(jié)果來(lái)自于分子印跡過(guò)程中的模板效應(yīng)。在所研究的模板濃度范圍內(nèi)印跡聚合物對(duì)DCB的非選擇性吸附作用達(dá)到可以忽略的程度。擬合后得到其線性回歸方程：Q/Ce=0.02638-2.32946Q（R2=0.9730），由直線斜率和截距可以求得結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)Kd=0.4293 mmoL/L，最大表觀結(jié)合量Qmax=0.01132 mmoL/g。

圖4 評(píng)價(jià)MIP結(jié)合性質(zhì)的Scatchard曲線Fig.4ScatchardplotstoestimatethebindingnatureofMIP

圖5 DCB及其類似物分子結(jié)構(gòu)式Fig.5ThemolecularstructuralformulasofDCBandanalogues

2.5 分子印跡整體柱印跡效應(yīng)和識(shí)別性能評(píng)價(jià)

為了探討MIP整體柱的識(shí)別性能，以模板DCB和其結(jié)構(gòu)類似物聯(lián)苯胺、鄰苯二胺、對(duì)氯苯胺、二苯胺、4-乙酰氨基酚為分析物（分子結(jié)構(gòu)如圖5），用體積組成為7：3的甲醇/水混合液作流動(dòng)相，在流速為0.5 mL/min和287 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)的條件下測(cè)定了分析物在印跡柱與非印跡柱上的保留時(shí)間，以此計(jì)算保留因子（retention factors，k＇）、分離因子（separation factors，α）和印跡因子（imprinting factors，IF）。丙酮作為不保留物質(zhì)用以測(cè)定體系的死時(shí)間，所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

按文獻(xiàn)［12］報(bào)道，分離因子（α）和印跡因子（IF）的定義分別為：

表1 DCB印跡和非印跡整體柱上選擇性系數(shù)的比較Table 1 Imprinted and nonimprinted monolithic column on the comparison of the selective coefficient

模板分子DCB在印跡柱上的保留因子k＇MIP為6.072，而在非印跡柱上的保留因子k＇NIP為1.845，根據(jù)印跡因子IF=k＇MIP/k＇NIP的定義［12］，印跡整體柱的印跡因子IF為3.291。從表1中可以看出在印跡柱上類似物相對(duì)于模板分子DCB的保留因子均明顯大于非印跡柱上的保留因子，這進(jìn)一步表明所獲得的DCB分子印跡整體柱對(duì)模板分子DCB具有優(yōu)異的識(shí)別能力和記憶效應(yīng)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用原位聚合法制備了3，3-二氯聯(lián)苯胺分子印跡聚合物整體柱，通過(guò)Scatchard分析證明其結(jié)合位點(diǎn)主要為一類等價(jià)結(jié)合點(diǎn)并求得該結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)Kd為0.4293 mmoL/L，最大表觀結(jié)合量Qmax為0.01132 mmoL/g。色譜實(shí)驗(yàn)證明該分子印跡整體柱對(duì)3，3-二氯聯(lián)苯胺呈現(xiàn)出較強(qiáng)的選擇性吸附能力和模板記憶效應(yīng)，以該柱為基礎(chǔ)有望實(shí)現(xiàn)建立DCB高選擇性色譜測(cè)定方法。

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Studyon Recognition Characteristicsof 3，3＇-dichlorobenzidine Imprinted Monolithic Column

ZHOU Tao1，CHEN Chang-bao1*，ZHOU Jie1，YOU Gui-rong2
1.College of Chemistry and Material Science，Shandong Agricultural University，Taian，271018，China
2.School of Pharmaceutics，Taishan Medical University，Taian 271016，China

Using3，3'-dichlorobenzidine asthe template，methacrylicacid（MAA）asthe functionalmonomer， azobisisobutyronitrile（AIBN）as a initiator，ethylene glycol dimethacrylate（EGDMA）as the cross-linker，BMIMPF6as the porogent，and the mixture of acetonitrile and chloroform as the solvent，a 3，3'-dichlorobenzidine imprinted monolithic column was prepared by in situ molecular imprinting technique，and its binding properties and selectivity were investigated. The3，3'-dichlorobenzidine molecularlyimprintedmonolithic polymerhasspecificrecognitionability for3，3'-dichlorobenzidine.3，3＇-dichlorobenzidine and its structural analogues were separated under selected conditions.

Molecular imprinting；3，3＇-dichlorobenzidine；high performance liquid chromatography（HPLC）；monolithic column

O657.7+2

A

1000-2324（2015）01-0033-05

2012-11-12

2013-01-22

國(guó)家自然基金（21175083）

周濤（1987-），女，碩士研究生，主要從事生物化學(xué)研究.E-mail：zhoutaonini1987@163.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail：chchbao@sdau.edu.cn