陳　煒，黃樹武，高玉廣，何　青，何乾超，黃德慶，張?jiān)?，劉　?/p>

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西　南寧　530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西　南寧　530000）

膠原酶與自體血建立腦出血模型的比較研究

陳煒1，黃樹武1，高玉廣2，何青2，何乾超1，黃德慶1，張?jiān)?，劉泰1

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530000）

目的比較膠原酶腦出血模型與自體血腦出血模型的穩(wěn)定性。方法分別采用膠原酶和自體血注入大鼠尾狀核建立腦出血模型，比較兩組模型死亡率、神經(jīng)功能缺陷評分、腦組織水含量、血腫大小、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的差異。結(jié)果假手術(shù)組術(shù)后神經(jīng)功能缺陷評分、腦水含量、血腫體積、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量未見明顯變化；膠原酶組成功率高于自體血組（P＜0.05）；兩組死亡率基本一致。膠原酶模型組24 h、3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺陷、腦水含量、血腫體積、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量均明顯高于自體血模型組（P＜0.05）。結(jié)論膠原酶腦出血模型較自體血腦出血模型穩(wěn)定。

膠原酶；自體血；腦出血模型；神經(jīng)功能缺陷；凋亡

腦出血（ICH）具有起病急、病情變化快、病死率高、致殘率高、再次出血率高等特點(diǎn)［1］。腦出血在西方國家約占急性腦卒中的15％，而在亞洲國家則高達(dá)20％～30％［2］。腦出血不僅發(fā)病率高，也是最嚴(yán)重、破壞性最強(qiáng)的腦卒中類型，其病死率高達(dá)30％～50％，而幾乎一半的生存者則會(huì)留下永久性的殘疾［3，4］，給患者和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。腦出血的病理生理是一個(gè)復(fù)雜的過程，由于在人體直接研究腦出血的損傷機(jī)制及防治方法有限，故腦出血?jiǎng)游锬Ｐ褪菄鴥?nèi)外研究腦出血疾病的必要工具，且研究腦出血的損傷機(jī)制、神經(jīng)功能的恢復(fù)以及相關(guān)的治療策略須選擇適合的模型。本文比較自體血腦出血模型與膠原酶腦出血模型的穩(wěn)定性，為研究腦出血的損傷機(jī)制提供合適的動(dòng)物模型。

1　材料與方法

1.1儀器和主要試劑腦立體定位儀（ST-4ND，成都儀器廠）；電子分析天平（AR2140，美國Ohaus公司）；恒冷冰凍切片機(jī)；單反數(shù)碼照相機(jī)（佳能EOS550D）；TUNEL試劑盒（批號(hào)：11684817910，Roche公司）；膠原酶Ⅶ（批號(hào)：SLBG8830V，美國Sigma公司）；PBS緩沖液（pH 7.2～7.4）、0.01 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH 6.0）、DAB顯色試劑盒（博士德生物技術(shù)有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組清潔級(jí)健康20～22月齡雄性SD大鼠135只，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK桂2009-0002）。

1.3動(dòng)物分組及模型的復(fù)制135只SD大鼠采用計(jì)算機(jī)產(chǎn)生隨機(jī)序列。隨機(jī)分出假手術(shù)組（45只）、膠原酶組（45只）、自體血組（45只）。每組分4個(gè)觀察時(shí)點(diǎn)，分別為手術(shù)后6 h、24 h、3 d、7 d。其中6 h、24 h、7 d每組大鼠各為10只，3 d每組大鼠各為15只。①自體血組：大鼠術(shù)前4 h禁食，2 h禁水，經(jīng)10％水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔注射麻醉后，固定于立體定位儀上。于前囟后1 mm，右側(cè)3 mm處鉆一直徑約1 mm的小孔，垂直進(jìn)針6 mm，使用微量注射器從大鼠心臟抽取50 μL自體血，在10 min內(nèi)緩慢注入到右側(cè)尾狀核，注入后停針5 min，緩慢退針；②膠原酶組：大鼠術(shù)前4 h禁食，2 h禁水，經(jīng)10％水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔注射麻醉后，參照Gary等［5］的方法，固定于立體定位儀上，使前囟和后囟在同一水平面上。于前囟后1 mm，右側(cè)3 mm處鉆一直徑約1 mm的小孔，使用立體定位儀上的微量注射器進(jìn)針6 mm，即為右側(cè)尾狀核的位置。在10 min內(nèi)注入膠原酶Ⅶ0.5U，注入完畢后停針5 min，緩慢退針；③假手術(shù)組：建立方法基本同膠原酶腦出血模型，但以等量生理鹽水代替膠原酶。

根據(jù)Longa′s的5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評分法判定模型成功與否。0分：正常，未見任何神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)；1分：垂直提起時(shí)前爪不能伸直；2分：行走時(shí)身體向左傾，向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時(shí)身體向左側(cè)跌倒；4分：不能自發(fā)行走或有意識(shí)障礙。通過此評分挑選合格動(dòng)物模型，評分在1～3分為合格。大鼠腦出血模型建立后，如有以下情形者予以剔除：神經(jīng)學(xué)癥狀評分低于1分或?yàn)?分者；取腦組織時(shí)發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血者；腦組織石蠟切片HE染色無出血病理學(xué)改變者；未到實(shí)驗(yàn)規(guī)定時(shí)間自動(dòng)死亡者。因上述原因?qū)е聦?shí)驗(yàn)動(dòng)物不足時(shí)，通過隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊。

1.4神經(jīng)功能缺損評分各亞組大鼠分別與造模前前1天及以后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。參照Gareia［6］評分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評分，最低3分，最高18分，分?jǐn)?shù)越高則神經(jīng)功能損害越輕，分?jǐn)?shù)越低則神經(jīng)功能損害越重。

1.5取材與處理各組術(shù)后清醒大鼠按時(shí)間點(diǎn)以Gareia評分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分后斷頭處死，剝離大腦組織，取出血側(cè)腦組織一部分進(jìn)行腦水含量的測定。另一部分置于4％甲醛溶液中固定保存，制作石蠟切片后用TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡。

1.6腦含水量測定不同組別、不同時(shí)間點(diǎn)麻醉大鼠，斷頭處死，迅速取出腦組織，用刀片以針尖為中心取厚度約4 mm出血側(cè)腦組織，立即稱濕重。將組織放入烘干箱100℃烘烤24 h再稱干重。按Elliot公式計(jì)算腦組織含水量：腦組織含水量（％）=（濕重-干重）/濕重×100％。

1.7血腫體積的測量取第3天時(shí)間點(diǎn)，每組取5只大鼠，斷頭取腦，經(jīng)4％多聚甲醛固定脫水后以注射針道為中心做冠狀切片，厚度約1 mm，用數(shù)碼相機(jī)拍攝切片后用ImageJ2x軟件測量病灶面積，血腫體積則為病灶面積×層數(shù)。

1.8TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡步驟：①脫蠟；②4％的多聚甲醛室溫固定；③PBS室溫浸洗5 min，重復(fù)1次；④微波熱修復(fù)；⑤加TUNEL反應(yīng)混合液。蓋上覆膜，37℃1 h；⑥移去覆膜，PBS室溫浸洗5 min×2次；⑦加Converter-POD反應(yīng)液。蓋上覆膜，37℃ 30 min；⑧移去覆膜，PBS室溫浸洗5 min ×2次；⑨加DAB顯色液室溫反應(yīng)約10 min；⑩透明封片，400倍鏡檢。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊則行LSD（L）檢驗(yàn)，方差不齊則取Tamhane′s T2檢驗(yàn)結(jié)果，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1造模成功率及死亡原因各組大鼠術(shù)后2 h進(jìn)行行為學(xué)評定。造模成功的大鼠左側(cè)肢體可見不同程度癱瘓，表現(xiàn)為左側(cè)前肢屈曲蜷縮，行走時(shí)向左側(cè)傾倒或左側(cè)轉(zhuǎn)圈，重者不能行走并出現(xiàn)伴意識(shí)障礙。無癥狀者或在未達(dá)到最短取材時(shí)間點(diǎn)死亡的大鼠均為造模失敗。

假手術(shù)組48例，其中3例麻醉意外死亡；膠原酶組大鼠56只，其中死亡8只，無癥狀3只，造模成功45只，成功率80.4％；自體血組大鼠70只，其中死亡10只，無癥狀者15只，造模成功45只，成功率64.3％（詳見表1）。大鼠死亡原因?yàn)槁樽硪馔?、呼吸心跳驟停、蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）、腦疝形成、感染（詳見表2）。通過對膠原酶組和自體血組的造模成功率和死亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠原酶組成功率高于自體血組（P＜0.05），兩組間死亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），死亡原因各組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1　各組模型建立情況

表2　各組大鼠死亡原因

2.2神經(jīng)功能缺損評分腦出血大鼠清醒后，假手術(shù)組未出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損，膠原酶組和自體血組出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，于3 d達(dá)到高峰。膠原酶組與自體血組6 h時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。膠原酶組24 h、3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分低于自體血組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

x±s，n=10）表3 各組大鼠腦出血后各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分情況（

2.3腦含水量測定大鼠腦出血術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血腫周圍腦組織含水量的變化如表4所示。膠原酶組和自體血組各時(shí)間點(diǎn)的腦組織含水量與假手術(shù)組比較均有明顯升高（P＜0.05）；24 h以后膠原酶組腦含水量明顯高于自體血組（P＜0.05）。

表4　各組大鼠腦出血后各時(shí)間點(diǎn)腦含水量（％±s，n=10）

表4　各組大鼠腦出血后各時(shí)間點(diǎn)腦含水量（％±s，n=10）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與膠原酶組同一時(shí)間比較，▼P＜0.05

組別6 h　24 h　3 d　7 d假手術(shù)組　76.30±1.06　77.80±1.81　78.20±1.55　76.40±1.17膠原酶組　79.50±4.32*　85.30±1.70　88.10±2.08　84.20±1.40自體血組　80.04±1.34*　83.10±1.20▼　84.20±1.87▼　81.90±1.10▼

2.4血腫體積比較術(shù)后第3天，假手術(shù)組未見明顯血腫，膠原酶組血腫不規(guī)則，呈彌漫性。自體血組血腫較規(guī)則，血腫體積較膠原酶組小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1　3 d血腫體積大小

2.5神經(jīng)元凋亡情況 各時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，陽性細(xì)胞被染成棕褐色，正?；蛘谠鲋车募?xì)胞不被染色，假手術(shù)組見少量凋亡細(xì)胞，膠原酶組和自體血組各時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），膠原酶組、自體血組24 h、3 d、7 d與6 h時(shí)間點(diǎn)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。膠原酶組24 h、3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞亡數(shù)量與自體血組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（見表5、圖2）。

表5　各組大鼠神經(jīng)元凋亡情況（x±s）

圖2　3 d時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞凋亡情況（×400）

3　討論

腦出血?jiǎng)游锬Ｐ统Ｒ姷挠凶泽w血注入法、膠原酶注入法、腦內(nèi)植入填充物法及自發(fā)性腦出血模型［7］。由于腦內(nèi)植入填充物法不能模擬腦出血病理生理特點(diǎn)［8］，自發(fā)性腦出血模型存在出血量及出血部位不穩(wěn)定等缺陷［9］，這兩種方法限制其在實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用，因此近年已基本不使用。目前常用的方法是自體血注入法及膠原酶誘導(dǎo)的腦出血［10］，然而這兩種造模方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。自體血誘導(dǎo)的腦出血模型可能接近于人類自發(fā)性腦出血的病理生理特點(diǎn)，適合用于研究腦出血后腦水腫形成繼發(fā)性腦損害的病理生理機(jī)制。但其取血困難，常用的有股動(dòng)脈取血、心臟取血和頸動(dòng)脈取血，但操作繁瑣，動(dòng)物死亡率高，采血時(shí)間過長容易導(dǎo)致凝血，血液從針孔反流導(dǎo)致血腫大小不穩(wěn)定［11］，且股動(dòng)脈取血影響大鼠的運(yùn)動(dòng)功能評分。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用20～22月齡SD大鼠，體重450～520 g，具有性情溫和、容易飼養(yǎng)、造模成本低廉等特點(diǎn)，大鼠神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能與人類相似，且老年大鼠的生理與人類發(fā)病年齡相符，接近臨床腦出血的特點(diǎn)。

腦出血后腦水腫的產(chǎn)生既有細(xì)胞毒性水腫，也有血管源性水腫形成，張揚(yáng)等［12］認(rèn)為：腦出血6 h內(nèi)腦水腫屬于細(xì)胞外水腫，原因是血腫壓迫周圍腦組織致局部微循環(huán)障礙，細(xì)胞器損傷，同時(shí)血腫、血塊回縮，釋放血漿和白蛋白，使間質(zhì)內(nèi)膠體滲透壓升高，通過滲透壓及流體靜力壓形成早期腦水腫；腦出血后第2天由于凝血酶以及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)會(huì)引起腦血管痙攣及星型膠質(zhì)細(xì)胞損傷，此時(shí)期引起細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫；此外，紅細(xì)胞裂解物也可導(dǎo)致腦血管和腦組織神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞損傷，引起腦水腫加重。有研究認(rèn)為［13］，高血壓早期強(qiáng)化降壓治療可顯著減少腦出血患者血腫擴(kuò)大、減輕腦水腫發(fā)生率，恢復(fù)和改善神經(jīng)功能，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)［14］，腦出血后AQP-4、IL-6及 MMP-9過度表達(dá)與腦細(xì)胞水腫具有正相關(guān)性。神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的檢測是常被用于評價(jià)藥物治療腦出血療效的指標(biāo)之一［15］。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)膠原酶注入法和自體血注入法兩組大鼠死亡率無差異，但是膠原酶組成功率高于自體血組，而且膠原酶組具有操作簡便、重復(fù)性好、血腫大小穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。因此，膠原酶注入法建立的腦出血模型適合用于評價(jià)藥物對腦出血后的治療效果的研究。

［1］劉泰，高玉廣，張青萍.活血化瘀法治療腦出血的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)研究，2015，34（8）：472-474.

［2］Qureshi AI，Tuhrim S，Broderick JP，et al.Spontaneous intracerebral hemorrhage［J］.N Engl J Med，2001，344（19）：1450-1460.

［3］Rosamond W，F(xiàn)legal K，F(xiàn)urie K，et al.Heart disease and stroke statistics-2008 update：a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee［J］.Circulation，2008，117（4）：e25-146.

［4］Woo D，Broderick JP.Spontaneous intracerebral hemorrhage：epidemiology and clinical presentation［J］.Neurosurg Clin N Am，2002，13（3）：265-279.

［5］Gary A Rosenberg，Sheila MB，Mary W，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21（2）：801-807.

［6］Garcia JH，Wagner S，Liu KF，et al.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rat.Statistical validation［J］. Stroke，1995，26（4）：627-634.

［7］孫輝利，余茜.腦出血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯窟M(jìn)展［J］.局解手術(shù)學(xué)雜志，2013，22（1）：82-83，86.

［8］安慶祝，毛穎，朱巍，等.植入異物法構(gòu)建自發(fā)性腦出血實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（50）：9934-9936.

［9］閆峰，吉訓(xùn)明，羅玉敏，等.多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦出血模型的制作［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2009，26（1）：38-40，51.

［10］張波，孫善全，邱國平，等.膠原酶和自體血注入法建立腦出血?jiǎng)游锬Ｐ偷谋容^［J］.解剖學(xué)雜志，2012，35（1）：75-78，103.

［11］張化彪，張?zhí)K明.腦出血模型［J］.國外醫(yī)學(xué)（腦血管疾病分冊），2002，10（6）：469-472.

［12］張揚(yáng)，趙文靜.腦出血后腦水腫的形成機(jī)制及治療［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，33（8）：558-560.

［13］熊聯(lián)強(qiáng)，李穎，鐘華.高血壓患者早期強(qiáng)化降壓治療對腦出血的影響［J］.中國藥業(yè)，2015，24（14）：48-50.

［14］謝巍，張波，宋世賓，等.大鼠腦出血后AQP-4、IL-6及MMP-9的表達(dá)與腦水腫的相關(guān)性研究［J］.貴州醫(yī)藥，2015，39（8）：686-690.

［15］馬全瑞，孫金萍，馬江波，等.黃芪聯(lián)合紅花對腦出血大鼠出血灶周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響［J］.臨床合理用藥雜志，2013，6（34）：1-3.

Comparative study on the model of intracerebral hemorrhage of collagenase and autologous blood establishment

CHEN Wei1，HUANG Shu-wu1，GAO Yu-guang2，HE Qing2，HE Qian-chao1，
HUANG De-qing1，ZHANG Yuan-kan1，LIU Tai1
（1.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China；2.Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530000，China）

Objective To compare the stability of collagenase model and autologous blood cerebral hemorrhage.Methods The model of intracerebral hemorrhage（ICH）was established by collagenase and autologous blood into caudate nucleus in rats.The model mortality，neurological deficit score，brain water content，the size of hematoma and the number of neuronal apoptosis were choosed to detect the difference of two models.Results No significant difference of the neurological deficit score，brain water content，the size of hematoma and the number of neuronal apoptosis after operation in sham operation group；The model success rate in collagenase group was obviously higher than the autologous blood group（P＜0.05）；The model mortality had no difference in two groups.At 24 h，3 d，7 d times，the neurological deficit score，brain water content，the size of hematoma and the number of neuronal apoptosisn of collagenase group were all higher than the autologous blood group（P＜0.05）.Conclusion The ICH model of rats established by collagenase was a stable model.

Collagenase；Autologous blood；Intracerebral hemorrhage model；Neurological deficit score；Apoptosis

R965.1

A

2095-5375（2015）12-0692-004

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（No.2013GXNSFAA019125）

陳煒，男，主治醫(yī)師，研究方向：腦血管疾病中醫(yī)藥防治，E-mail：liutai590216@163.com

劉泰，男，主任醫(yī)師，教授，研究生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是腦血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合臨床、科研和教學(xué)工作，Tel：0771-5848502，E-mail：liutai590216@163.com