王明等

摘 要 以24個(gè)橡膠樹主栽品種為試材，從75對SSR引物中篩選到14對多態(tài)性引物，構(gòu)建了24個(gè)品種的指紋圖譜。結(jié)果每對引物可以檢測到2～5個(gè)數(shù)目不等多態(tài)性等位基因，平均為4.00個(gè)等位基因，PIC 平均值為0.48。聚類分析可將24份主栽品種分為三大類，具有相同來源的多數(shù)品種聚為一類。24個(gè)橡膠品種的SSR指紋圖譜互不相同，可以作為各品種的特定圖譜。

關(guān)鍵詞 橡膠樹 ；SSR標(biāo)記 ；聚類分析 ；品種鑒別

分類號 S794.1

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）屬大戟科（Euphobiaceae）橡膠樹屬（Hevea），是生產(chǎn)天然橡膠膠乳的主要樹種。天然橡膠不僅是重要的工業(yè)原料，而且是一種重要的戰(zhàn)略資源，在國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1]。準(zhǔn)確地鑒別巴西橡膠樹品種或無性系，建立可靠的巴西橡膠樹品種或無性系分類和鑒定體系具有重要意義。以往巴西橡膠樹品種或無性系的分類與鑒定，仍延用1963年創(chuàng)立的以蜜腺、大葉枕、小葉柄、葉脈、葉形、株形等形態(tài)特征為基礎(chǔ)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，但形態(tài)鑒定易受形態(tài)性狀的數(shù)量限制，多態(tài)性差、時(shí)間長，且容易受環(huán)境影響的特點(diǎn)[2]。特別是天然橡膠樹栽培種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)狹窄，經(jīng)50多年的近親繁殖和選擇育種，目前生產(chǎn)上使用的主栽品種形態(tài)差異較小，多數(shù)是全同胞或半同胞品種，僅用形態(tài)學(xué)很難進(jìn)行區(qū)分。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、有效的方法，用于橡膠樹主栽品種鑒定，將有助于解決生產(chǎn)中品種鑒定難的問題。

DNA分子標(biāo)記反映的是遺傳本質(zhì)上的差異，用于品種鑒定時(shí)具有周期短、不受環(huán)境條件影響、真實(shí)可靠等優(yōu)點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了多種DNA分子標(biāo)記技術(shù)，如RAPD、RFLP、SSR、ISSR、AFLP等，其中SSR被認(rèn)為是一種十分有效的分子標(biāo)記技術(shù)，已被應(yīng)用于評價(jià)遺傳多樣性、指紋圖譜和繪制遺傳圖譜等各類巴西橡膠樹研究中。華玉偉等[3]利用11 809條橡膠樹ESTs，檢索到258個(gè)SSR位點(diǎn)，最終篩選到40對具有多態(tài)性的SSR引物。謝黎黎等[4]從88對SSR標(biāo)記中篩選5對，用于構(gòu)建87 份橡膠樹無性系的指紋圖譜。馮素萍等[5]以熱研88-13×IAN873 的94 個(gè)F1群體，建立了91個(gè)SSR標(biāo)記的共18個(gè)連鎖群，覆蓋橡膠樹基因組1 937.06 cM。李維國等[6]利用19 對引物對41 份橡膠樹材料進(jìn)行多態(tài)性檢測，共獲得92 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)， 每對引物檢測到的等位基因數(shù)為2～7 個(gè)，平均為4.84 個(gè)。龍青姨等[7]利用25 對EST-SSRs 引物， 對中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國家橡膠樹種質(zhì)資源圃中保存的來自6 個(gè)國家的278 份魏克漢種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳分化分析。Gouvêa等[8]對來自包括亞洲，非洲和亞馬遜等60個(gè)橡膠樹基因型遺傳多樣性， 利用68個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記，可將這些種質(zhì)分為6組。Souza等[9]利用284個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建23個(gè)連鎖群，總長度為2 688.8 cM。

筆者利用已有的SSR分子標(biāo)記對我國現(xiàn)有橡膠樹主栽品種資源篩選高效SSR標(biāo)記，構(gòu)建指紋圖譜并進(jìn)行親緣關(guān)系分析，以便為快速準(zhǔn)確鑒定橡膠樹品種提供技術(shù)支撐，對育成新品種進(jìn)行有效保護(hù)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)24個(gè)橡膠樹主栽品種均取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國家橡膠樹種質(zhì)資源圃，材料具體名稱見表1。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取與檢測

取變色期葉片，總DNA提取參照改良CTAB法[9]。取1 μL樣品于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用紫外分光光度計(jì)檢測DNA純度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與檢測

本研究所用的標(biāo)記均來自于前人已開發(fā)的SSR標(biāo)記，合成75對SSR引物[3-4，9]、PCR產(chǎn)物擴(kuò)增、6%聚丙烯酰氨凝膠電泳、染色方法見Creste等[10]的研究。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析與處理

SSR引物擴(kuò)增每條多態(tài)性帶視為1個(gè)等位基因位點(diǎn)，將觀察到的每條帶視為一個(gè)性狀，有帶時(shí)賦值為“1”，無帶時(shí)賦值為“0”，建立數(shù)據(jù)庫；用NTSYS-pc 2.10 e分析軟件進(jìn)行遺傳相似性系數(shù)計(jì)算，并按UPMGA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀系譜圖。計(jì)算SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC）。PIC=1-∑Pi2，其中Pi表示i位點(diǎn)的基因頻率，利用Popgene軟件計(jì)算香農(nóng)指數(shù)（I）和基因多樣性（GD）。

1.2.4 指紋圖譜構(gòu)建

將每個(gè)品種的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物所有譜帶按擴(kuò)增片段從小到大的順序編號，用二位代碼描述（依次為01、02……），對照參照品種的譜帶確定待測樣品的基因型。純合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為XX，其中X為該位點(diǎn)譜帶的代碼；雜合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為XY，其中X、Y為該位點(diǎn)上2個(gè)不同的譜帶。小片段在前，大片段在后。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

根據(jù)SSR擴(kuò)增結(jié)果，每對引物檢測的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)為2～10個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為2～5個(gè)，多態(tài)性比例為44.4%～100.0%（圖1為標(biāo)記SSR 39電泳圖）。平均香農(nóng)信息指數(shù)為0.95；基因多樣性變幅為0.12～0.76，平均值為0.54；PIC值變幅為0.11～0.71，平均值為0.48。見表2。

2.2 指紋圖譜構(gòu)建

記錄24個(gè)品種的SSR分子指紋圖譜（表3）。

2.2 種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)及聚類分析

根據(jù)SSR分子標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)不同基因型數(shù)據(jù)結(jié)果，利用NTSYS-pc V 2.10軟件，采用UPGMA計(jì)算24個(gè)主栽品種兩兩間的遺傳相似系數(shù)，得到相似系數(shù)矩陣。結(jié)果表明，24個(gè)主栽品種遺傳相似系數(shù)次數(shù)分布圖可知（圖2），遺傳相似性主要集中在0.55～0.80，占80%，近20%分布于兩側(cè)，說明天然橡膠的遺傳性狀差異較小，多樣性較低。

根據(jù)24個(gè)主栽品種遺傳相似系數(shù)矩陣，對品種進(jìn)行聚類分析并建立聚類性狀圖（圖3）。

以0.68為閾值，24份橡膠樹品種可分為3類：第一類包括18份材料，第二類包括5份材料，第三類包括1份材料。通過對24個(gè)品種聚類分析發(fā)現(xiàn)，具有相同來源的多數(shù)品種聚為一類，如第一類中的多數(shù)品種（熱研7-20-59、熱研7-33-97、文昌11、保亭235、熱研78-3-5、熱研88-13、熱研6-231）含RRIM600的遺傳背景，與RRIM600聚在一起。含有GT1背景的云研77-2與GT1聚為一起，但也有例外，如含有PR107背景的湛試327-13，并未與PR107聚為一類。總之，遺傳相似系數(shù)聚類分析結(jié)果基本上反映了品種之間的親緣關(guān)系。

3 討論

微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）由于具有多態(tài)性高、共顯性、重復(fù)性好和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為研究種質(zhì)資源遺傳多樣性、指紋圖譜構(gòu)建的首選標(biāo)記。劉冠明等[11]對南方花生主產(chǎn)區(qū)20個(gè)品種進(jìn)行了SSR分析，并構(gòu)建其指紋圖譜，該圖譜能將19個(gè)品種相互區(qū)分。Bredemeijer等[12]用20個(gè)SSR引物構(gòu)建了500個(gè)馬鈴薯品種的DNA 指紋圖譜，能準(zhǔn)確地將其中的純合品種鑒定出來。郭海林等[13]用2對引物建立了11個(gè)結(jié)縷草優(yōu)良品系的DNA指紋圖譜。本研究利用14對多態(tài)性SSR標(biāo)記，對24份橡膠樹主栽品種進(jìn)行分析，這24份橡膠樹主栽品種幾乎涵蓋了中國目前生產(chǎn)上使用的主栽品種。本研究建立的指紋數(shù)據(jù)庫對橡膠樹品種鑒定和品種保護(hù)具有理論和現(xiàn)實(shí)意義。

此外，遺傳相似性次數(shù)分布圖未呈正態(tài)分布，絕大部分遺傳相似性集中在0.55～0.80，另有將近20%的相似性次數(shù)分布在兩側(cè)，說明橡膠樹主栽群體遺傳信息較為狹隘，遺傳差異較小。橡膠樹栽培種質(zhì)都起源于魏克漢從原產(chǎn)地亞馬遜河流域引種的野生種質(zhì)，經(jīng)過馴化形成了栽培品種，且育種工作者又往往選用生產(chǎn)性狀比較優(yōu)良的品種作親本，這樣，使很多品種之間的親緣關(guān)系比較近，也使得橡膠樹品種的遺傳基礎(chǔ)變得越來越狹窄。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也恰恰證明了這一點(diǎn)。當(dāng)遺傳基礎(chǔ)比較狹窄的群體遭遇較大自然災(zāi)害時(shí)，容易大面積受害。因此，深入了解橡膠樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性，利于有針對性地選擇雜交親本，從而在實(shí)際選育種中選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的親本

進(jìn)行組配，有望獲得較大的雜種優(yōu)勢，育成高產(chǎn)、抗寒的橡膠樹新品種。

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