張倩，袁碧波△，王彥，許毅

MCL-1和FBW7蛋白在紡錘絲毒性藥物誘導(dǎo)的乳腺癌多倍體中的表達及臨床意義

張倩1，袁碧波1△，王彥1，許毅2

目的探討MCL-1和FBW7蛋白在紡錘絲毒性藥物誘導(dǎo)的乳腺癌多倍體中的表達及臨床意義。方法（1）以紡錘絲毒性藥物Nocodazole處理人乳腺癌MDA-MB-231細胞，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，并于0、6、12、24、48及72 h收獲細胞，流式細胞術(shù)檢測細胞周期和染色體倍體變化，Western blot檢測細胞中FBW7和MCL-1蛋白的表達。（2）用多激酶抑制劑索拉非尼（Sorafenib）分別與Nocodazole、紫杉醇（Taxol）聯(lián)合或單獨處理細胞，Western blot檢測處理48 h后各組細胞中MCL-1蛋白的表達，流式細胞術(shù)檢測處理48 h細胞周期和染色體倍體變化，MTT法檢測處理48、72 h細胞增殖情況。結(jié)果（1）Nocodazole處理后，細胞出現(xiàn)體積增大、核大的多倍體形態(tài)學(xué)改變，0、6、12、24、48及72 h八倍體細胞所占百分比分別為（0.8±0.2）%、（8.5±2.3）%、（7.8±2.0）%、（9.9±0.9）%、（28.2± 0.8）%及（35.1±4.9）%，逐漸增加（P＜0.001），48 h后多倍體（四倍體和八倍體）細胞數(shù)高達（97.6±0.7）%；隨時間延長，F(xiàn)BW7蛋白表達量減少，MCL-1蛋白表達量增加。（2）處理細胞48 h后，Nocodazole+Sorafenib組較Nocodazole組、Taxol+Sorafenib組較Taxol組MCL-1蛋白表達量均明顯減少，多倍體細胞均減少，細胞生長增殖率下降（P＜0.05）。結(jié)論FBW7蛋白低表達，MCL-1蛋白高表達與乳腺癌多倍體細胞的形成密切相關(guān)；Sorafenib抑制MCL-1蛋白表達，可能減少多倍體腫瘤形成。

乳腺腫瘤；多倍性；體外研究；MCL-1；FBW7；紡錘絲毒性藥物；Nocodazole；索拉非尼

惡性腫瘤易產(chǎn)生耐藥和復(fù)發(fā)，紫杉醇、長春新堿等紡錘絲毒性藥物是腫瘤化療的一線藥物［1］。這類藥物可誘導(dǎo)某些腫瘤細胞發(fā)生凋亡，而對另一些卻誘導(dǎo)其產(chǎn)生多倍體，使腫瘤細胞對常用化療藥物更加耐藥而致治療失敗［2］。有研究認(rèn)為多倍體腫瘤形成的分子機制復(fù)雜，卵巢癌、非小細胞肺癌中F-box and WD repeat domain-containing 7（FBW7）缺乏，myeloid cell leukemia-1（MCL-1）高表達可促進有絲分裂滑動、核內(nèi)復(fù)制，可能是導(dǎo)致多倍體腫瘤形成和對化療藥耐藥的重要原因［3］。FBW7缺失，MCL-1過表達的情況下，急性T淋巴細胞白血?。═-ALL）對索拉非尼（Sorafenib）藥物非常敏感，Sorafenib可通過抑制MCL-1表達發(fā)揮抗癌作用［4］。本研究旨在探討MCL-1和FBW7蛋白在紡錘絲毒性藥物誘導(dǎo)的乳腺癌多倍體中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料人乳腺癌MDA-MB-231細胞由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部腫瘤研究中心柯楊教授惠贈，常規(guī)傳代培養(yǎng)。Sorafenib購自Cayman公司，紫杉醇（Taxol）購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，Nocodazole購自Sigma公司，F(xiàn)BW7鼠抗人單克隆抗體和MCL-1兔抗人單克隆抗體購自Abcam公司，噻唑蘭（MTT）、Western及RIPA細胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所，碘化丙啶（PI）和核糖核酸酶（RNase）購自Solar?bio公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的形態(tài)學(xué)變化人乳腺癌MDA-MB-231細胞接種于含有10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細胞，用紡錘絲毒性藥物100 μg/L Nocodazole處理，于顯微鏡下觀察Nocodazole處理前后細胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和染色體倍體變化用100 μg/L Nocodazole分別處理對數(shù)生長期細胞0、6、12、24、48及72 h，消化、收集細胞，70%冷乙醇固定，4℃過夜后1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，PBS洗滌，加入100 ng/L RNase 37℃孵育30 min，加入500μL PI染色液室溫避光孵育30 min，計數(shù)1×106個/mL細胞，流式細胞儀檢測細胞周期（G0/S、G2/M），并測定二倍體、四倍體和八倍體細胞分別占細胞總數(shù)的百分比。

1.2.3 Western blot檢測FBW7和MCL-1蛋白表達水平用100 μg/L Nocodazole分別處理對數(shù)生長期細胞0、6、12、24、48及72 h，收集細胞，用細胞裂解液RIPA裂解提取蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離，恒壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，膜封閉液封閉1 h，然后一抗孵育（FBW7 1∶1 000，MCL-1 1∶1 000）4℃過夜，相應(yīng)的二抗孵育1 h（1∶5 000，1∶4 000），熒光發(fā)光成像分析儀檢測蛋白質(zhì)印跡，β-actin作為內(nèi)參。

1.2.4 各組MCL-1蛋白表達量和細胞周期檢測使用多激酶抑制劑2μmol/L Sorafenib與100 μg/L Nocodazole、100 nmol/L Taxol聯(lián)合或單獨處理細胞48 h。實驗分組：No?codazole+Sorafenib組、Taxol+Sorafenib組、Nocodazole組、Taxol組、Sorafenib組和只加RPMI 1640培養(yǎng)液的空白對照（control）組。Western blot檢測聯(lián)合使用Sorafenib與單用紡錘絲毒性藥物間MCL-1蛋白表達水平。流式細胞術(shù)檢測聯(lián)合使用Sorafenib與單用紡錘絲毒性藥物間細胞周期和染色體倍體變化。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖取對數(shù)生長期細胞，以5×103個/孔接種于96孔板，使用2、4μmol/L Sorafenib分別與100 μg/ L Nocodazole、100 nmol/LTaxol聯(lián)合或單獨處理細胞48和72 h后終止培養(yǎng)，每個分組5個復(fù)孔，終止培養(yǎng)前4 h加入5 g/L MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，除去每孔中培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜200μL/孔，振蕩至結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀檢測各孔波長490 nm處的吸光度（A）值，計算細胞生長增殖率=A藥物組/A對照組× 100%。比較聯(lián)合使用Sorafenib與單用紡錘絲毒性藥物間細胞增殖的差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDA-MB-231細胞形態(tài)學(xué)變化Nocodazole處理前MDA-MB-231細胞呈梭形貼壁生長，No?codazole處理后細胞出現(xiàn)體積增大，細胞核大等典型的多倍體細胞形態(tài)學(xué)改變，見圖1。

Fig.1 Morphological changes of MDA-MB-231cells before and after Nocodazole treatment（×100）圖1 顯微鏡下Nocodazole處理前后MDA-MB-231細胞形態(tài)學(xué)變化（×100）

2.2 細胞周期和染色體倍體變化Nocodazole處理細胞6 h開始出現(xiàn)G2/M期停滯，24 h完全停滯在G2/M期，24 h后多倍體（四倍體和八倍體）細胞形成顯著增多，見圖2a。0、6、12、24、48及72 h八倍體細胞所占百分比分別為（0.8±0.2）%、（8.5±2.3）%、（7.8± 2.0）%、（9.9±0.9）%、（28.2±0.8）%及（35.1±4.9）%，12 h后呈增加趨勢（F=91.417，P＜0.001），48～72 h多倍體細胞數(shù)所占比例達到高峰（97.6±0.7）%，見圖2b。

Fig.2 DNA content and percentages of diploid，tetraploid and octaploid of MDA-MB-231 cells at different time points after treatment by Nocodazole圖2 Nocodazole處理不同時間后MDA-MB-231細胞DNA含量（a）和各倍體細胞所占百分比（b）

2.3 細胞中FBW7、MCL-1蛋白表達水平隨No?codazole處理時間的延長，細胞中FBW7蛋白表達量減少，MCL-1蛋白表達量增加，且48 h后差異顯著，見圖3。

Fig.3 The expressions of FBW7 and MCL-1 in MDA-MB-231cells at different time points after treatment by Nocodazole圖3 Nocodazole處理不同時間后MDA-MB-231細胞中FBW7和MCL-1蛋白表達

2.4 聯(lián)合使用Sorafenib與單用紡錘絲毒性藥物對MCL-1蛋白表達量、細胞周期的影響Nocodazole+ Sorafenib組較Nocodazole組、Taxol+Sorafenib組較Taxol組MCL-1蛋白表達量均明顯減少，二倍體細胞均增多，多倍體細胞均減少（P＜0.05），見圖4、5，表1。

Fig.4 The expressions of MCL-1 in MDA-MB-231 cells after 48 h treatment by different drugs圖4 不同藥物處理48 h后MDA-MB-231細胞中MCL-1蛋白表達

Fig.5 DNA content of MDA-MB-231 cells after 48 h treatment by different drugs圖5 不同藥物處理48 h后的MDA-MB-231細胞DNA含量

2.5 聯(lián)合使用Sorafenib與單用紡錘絲毒性藥物對細胞增殖的影響藥物處理48、72 h時，100 μg/LNocodazole+2μmol/L Sorafenib組較100 μg/L No?codazole組，100 nmol/L Taxol+2μmol/L Sorafenib組較100 nmol/L Taxol組，100 μg/L Nocodazole+4μmol/L Sorafenib組較100 μg/L Nocodazole+2μmol/L Sorafenib組，100 nmol/L Taxol+4μmol/L Sorafenib組較100 nmol/L Taxol+2μmol/L Sorafenib組細胞生長增殖率均明顯降低（P＜0.01），見表2。

Tab.1 Percentages of diploid，tetraploid and octaploid after 48 h treatment by different drugs表1 不同藥物處理MDA-MB-231細胞48 h后各倍體細胞所占百分比（n=3，%）

Tab.1 Percentages of diploid，tetraploid and octaploid after 48 h treatment by different drugs表1 不同藥物處理MDA-MB-231細胞48 h后各倍體細胞所占百分比（n=3，%）

＊＊P＜0.01

組別Nocodazole+Sorafenib組Nocodazole組t Taxol+Sorafenib組Taxol組t 2 n 15.3±1.1 3.7±1.2 12.115＊＊47.7±1.1 21.4±1.4 25.353＊＊4 n 65.0±0.1 68.0±1.6 3.346＊49.4±0.8 67.1±1.1 23.065＊＊8 n 8.6±0.1 28.2±0.8 12.557＊＊0.8±0.7 10.5±1.3 10.920＊＊

Tab.2 The relative cell proliferation rates of MDA-MB-231 cells after different time treatment by different drugs表2 MDA-MB-231細胞經(jīng)不同藥物培養(yǎng)不同時間后的相對增殖率（n=5，%）

Tab.2 The relative cell proliferation rates of MDA-MB-231 cells after different time treatment by different drugs表2 MDA-MB-231細胞經(jīng)不同藥物培養(yǎng)不同時間后的相對增殖率（n=5，%）

＊＊P＜0.01；a與（1）比較，b與（2）比較，c與（4）比較，d與（5）比較，均P＜0.01

72 h 80.1±3.1 56.4±3.5a36.9±3.0ab210.381＊＊82.1±2.9 65.9±1.8c44.3±2.0cd395.234＊＊組別100 μg/L Nocodazole組（1）100 μg/L Nocodazole+2μmol/L Sorafenib組（2）100 μg/L Nocodazole+4μmol/L Sorafenib組（3）F 100 nmol/L Taxol組（4）100 nmol/L Taxol+2μmol/L Sorafenib組（5）100 nmol/L Taxol+4μmol/L Sorafenib組（6）F 48 h 82.3±2.0 61.2±3.5a45.1±3.0ab137.857＊＊83.3±3.6 72.4±1.8c61.0±1.2cd74.798＊＊

3 討論

多倍體腫瘤的形成途徑包括核內(nèi)復(fù)制、有絲分裂滑動、細胞分裂失敗和細胞融合［5］。但與紫杉醇等化療藥誘導(dǎo)多倍體腫瘤形成有關(guān)的途徑是有絲分裂滑動［6］，其在腫瘤細胞有絲分裂過程中影響紡錘絲的結(jié)構(gòu)和功能，激活紡錘絲控制點，誘導(dǎo)細胞凋亡［7］；然而有些細胞無視紡錘絲結(jié)構(gòu)和功能的破壞，細胞核不分裂，但仍能進入下一個細胞周期，形成四倍體、八倍體，稱為有絲分裂滑動，形成多倍體腫瘤，增強了其對化療藥物的耐藥性［7］。本研究結(jié)果顯示，紡錘絲毒性藥物可誘導(dǎo)人乳腺癌MDA-MB-231細胞多倍體化，出現(xiàn)細胞體積增大、核大等典型的多倍體形態(tài)學(xué)改變，且藥物處理48 h后多倍體細胞數(shù)高達97.6%。因此，治療多倍體腫瘤可能是治療腫瘤耐藥的新突破口。

本研究結(jié)果同時顯示，紡錘絲毒性藥物處理細胞48 h后，F(xiàn)BW7蛋白表達降低，MCL-1蛋白表達顯著升高，提示MDA-MB-231細胞多倍體的形成可能與FBW7低表達，MCL-1高表達有關(guān)。有研究報道，MCL-1作為BCL-2家族中重要的抗凋亡蛋白，是紡錘絲毒性藥物誘導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［4］。FBW7/Cdc4（SKP1-cullin-1-F-box complex，SCFFBW7）通過識別磷酸化基團，泛素化降解下游致癌蛋白MCL-1，促進細胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用［3-4，8］。因此，筆者推測FBW7低表達及缺乏可能致使MCL-1的泛素化降解減弱，從而導(dǎo)致細胞中MCL-1高表達，這一機制可能在多倍體腫瘤的形成中起著關(guān)鍵的作用。Wang等［9］研究認(rèn)為，T-ALL、結(jié)腸癌細胞、乳腺癌細胞等多種癌細胞中FBW7表達缺失、MCL-1過表達與腫瘤耐藥密切相關(guān)。Akhoondi等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在人類各種原發(fā)腫瘤中含有平均大約6%的FBW7失活突變率，F(xiàn)BW7在膽管細胞癌、T-ALL、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌和胃癌中的突變率分別為35%、31%、9%、9%和6%。

為進一步證實MCL-1高表達與多倍體腫瘤形成有關(guān)，本研究應(yīng)用多激酶抑制劑Sorafenib與紡錘絲毒性藥物聯(lián)合處理細胞。研究認(rèn)為，Sorafenib通過抑制Raf激酶使MAPK信號通路失活，從而降低MCL-1的表達水平［11-13］。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合應(yīng)用Sorafenib較單用紡錘絲毒性藥物MCL-1蛋白表達量明顯減少，多倍體細胞也明顯減少，細胞生長增殖率降低，表明其藥物敏感性增加；同時隨Sorafenib藥物濃度增加，作用時間延長，細胞生長增殖率依次降低。

綜上所述，F(xiàn)BW7蛋白低表達，MCL-1蛋白高表達與乳腺癌多倍體細胞的形成密切相關(guān)，通過Sorafenib抑制MCL-1的表達，可能降低多倍體的形成，增加藥物敏感性，有望成為攻克腫瘤耐藥的新方案。

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（2015-03-10收稿2015-05-08修回）

（本文編輯陸榮展）

Expression and clinical significance of MCL-1 and FBW7 proteins in breast cancer polyploid induced by spindle poisons

ZHANG Qian1，YUAN Bibo1△，WANG Yan1，XU Yi2
1 Department of Gynecology and Obstetrics，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China；2 Hebei Tsinghua Development Research Institute△

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of myeloid cell leukemia-1（MCL-1）and F-box and WD repeat domain-containing 7（FBW7）in breast cancer polyploid induced by spindle poisons.Methods（1）Nocodazole spindle poison was used to treat breast cancer cell MDA-MB-231.The morphological changes of cells were ob?served under microscope，and cells were harvested in 0，6，12，24，48 and 72 h.The cell cycle and DNA-ploidy changes were examined by flow cytometry.The expressions of FBW7 and MCL-1 proteins were detected by Western blot assay.（2）A multikinase inhibitor（Sorafenib）with Nocodazole or Taxol was used to treat MDA-MB-231 cells.MCL-1 protein expression was detected by Western blot assay after 48 h treatment.The cell cycle and DNA-ploidy changes were examined by flow cy?tometry after 48 h treatment.MTT method was used to observe cell proliferation after 48 and 72 h treatment.Results（1）Af?ter treatment by Nocodazole，polyploid characteristics of large cell size and nucleus were appeared.The percentages of octa?ploid were（0.8±0.2）%，（8.5±2.3）%，（7.8±2.0）%，（9.9±0.9）%，（28.2±0.8）%and（35.1±4.9）%after 0，6，12，24，48 and 72 h treatment，showing the increasing trend in turn（P＜0.001）.The number of polyploidy（tetraploid and octaploid）cells was as high as（97.6±0.7）%after 48 h treatment.The expression level of FBW7 protein was decreased significantly but the expres?sion of MCL-1 protein was increased significantly after 48 h treatment.（2）After 48 h treatment，the expression level of MCL-1 protein，polyploidy percentage and cell proliferation decreased significantly in Nocodazole+Sorafenib group and Taxol+Sorafenib group compared with those of Nocodazole group and Taxol group（P＜0.05）.ConclusionThe lower expression of FBW7 protein and over-expression of MCL-1 protein are correlated with the formation of breast cancer polyploidy. Sorafenib can reduce polyploid tumor cells by inhibiting MCL-1 protein expression.

breast neoplasms；polyploidy；in vitro；myeloid cell leukemia-1；F-box and WD repeat domain-containing 7；spindle poison；Nocodazole；sorafenil

R737.9；R349.12

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.003

國家自然科學(xué)基金資助項目（30872969）

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科（郵編300052）；2河北省清華發(fā)展研究院

張倩（1988），女，碩士在讀，主要從事婦科腫瘤耐藥機制的研究

△通訊作者E-mail：yuanbibo@hotmail.com