邵冰水 毛沖沖 翟廣 劉獻(xiàn)志

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科 河南 鄭州 450052)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的40% ～50%［1］。近年來，雖然神經(jīng)外科的技術(shù)水平、放療設(shè)備和化療藥物等方面都有了長足發(fā)展，但由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有侵襲性生長，與正常的腦組織相粘連、分解不清，對放、化療高度抵抗等特點(diǎn)，治療效果并不理想。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)屬于胞漿蛋白家族，具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能［2］。P16 又叫做MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是一種抑癌基因，它可以調(diào)控細(xì)胞周期，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及分裂。本實(shí)驗(yàn)的目的是研究人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中STAT3 和P16 表達(dá)情況，進(jìn)行差異性及相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)而探討二者在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和相互關(guān)系，為臨床的診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2012年10月至2013年11月期間鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院75 例膠質(zhì)瘤患者術(shù)中切除的膠質(zhì)瘤組織和臨床資料，根據(jù)病理檢測結(jié)果，其中男性患者42 例，女性患者33 例，年齡在14 ～72 歲之間，平均年齡為(43.28 ±13.65)歲。其中年齡＜43 歲患者45 例，年齡≥55 歲患者29 例。腫瘤直徑≤3 cm的患者13 例，直徑3 ～5 cm 的患者28 例，直徑＞5 cm的患者33 例。按照WHO(2000年)膠質(zhì)瘤病理分級標(biāo)準(zhǔn)，可分為Ⅰ級17 例，Ⅱ級20 例，Ⅲ級18 例，Ⅳ級20 例。將Ⅰ級、Ⅱ級歸為低級別組，Ⅲ級、Ⅳ級歸為高級別組。另外收集10 例該科室同時(shí)期因重度顱腦外傷行內(nèi)減壓手術(shù)切除的腦組織作為正常腦組織(切片均經(jīng)病理科醫(yī)師審定)。選取標(biāo)準(zhǔn):所有患者無其他嚴(yán)重合并癥，均為首次行手術(shù)治療，術(shù)前均未行放療、化療等治療。相關(guān)影像學(xué)檢查均于手術(shù)前完善。所有標(biāo)本在手術(shù)切除之后30 min 內(nèi)放入液氮罐中，然后置于－80℃Thermol 低溫冰箱中進(jìn)行保存。所取標(biāo)本均通過本院倫理學(xué)委員會(huì)及患者家屬同意。

1.2 主要儀器與實(shí)驗(yàn)試劑

1.2.1 主要儀器 圖像采集采用顯微數(shù)碼照像系統(tǒng)(德國Lecia);圖片分析系統(tǒng)及其他儀器由本院病理科提供。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗人STAT3 多克隆抗體及鼠抗人P16 單克隆抗體均購于武漢博士德公司;S－P9000試劑盒、DAB 顯示增強(qiáng)劑、PBS、蘇木素染液等均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 先用4%甲醛將組織標(biāo)本固定1 h，石蠟包埋;用多聚賴氨酸對載玻片進(jìn)行預(yù)防脫片處理;切片(厚約3 μm);采用S－P 免疫組化法對75 例人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤及10 例正常腦組織進(jìn)行STAT3 及P16 蛋白的特異性檢測，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。流程如下:切片脫蠟、沖洗、烤片;冷卻后用蒸餾水、PBS 緩沖液反復(fù)沖洗;H2O250 μl 滴加在切片標(biāo)本上，室溫下孵育15 min，再次沖洗;滴加1∶100 稀釋的一抗，陰性對照組用PBS 緩沖液代替一抗，將切片和保濕盒一同放入4℃恒溫箱過夜(約16 ～18 h);PBS緩沖液沖洗、復(fù)溫，再次沖洗;DAB 顯色;蘇木素復(fù)染;常規(guī)乙醇梯度脫水;封片(中性樹膠)，觀察。

1.4 結(jié)果分析 雙人雙盲法觀察切片，將陽性著色細(xì)胞所占視野內(nèi)細(xì)胞的百分比與細(xì)胞著色強(qiáng)度相結(jié)合計(jì)算(二級計(jì)分法)。具體標(biāo)準(zhǔn)如下:未著色為0 分，弱染色為1 分，中等染色為2 分，強(qiáng)染色為3 分。然后按著色陽性細(xì)胞占同類細(xì)胞數(shù)的百分比給予計(jì)分:1 分(0% ～5%)，2 分(6% ～25%)，3 分(26% ～50%)和4 分(＞50%)。最終的結(jié)果為陽性細(xì)胞的百分率計(jì)分和染色強(qiáng)度計(jì)分的乘積產(chǎn)生的加權(quán)分?jǐn)?shù)，即:0 分為陰性(－)，1 ～4 分為弱陽性(+ )，5 ～8 分為陽性(+ +)，9 ～12 分為強(qiáng)陽性(+ + +)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。陽性表達(dá)情況的比較采用χ2檢驗(yàn)與Spearman 秩相關(guān)法進(jìn)行相關(guān)性分析，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STAT3 在正常腦組織和人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá) STAT3 蛋白表達(dá)的陽性信號主要位于胞漿中，少量位于胞核。在10 例正常腦組織標(biāo)本中，STAT3 表達(dá)全陰性。在低級別人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，STAT3 的陽性表達(dá)率為37.84%(14/37)，高級別組為71.05%(27/38);STAT3 在低級別組人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平明顯低于高級別組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。按照秩相關(guān)法對表達(dá)水平和病理級別進(jìn)行分析，得出相關(guān)系數(shù)r=0.457，P=0.000。見圖1、2、3。

圖1 STAT3 在正常腦組織中的表達(dá)(SP×400)

圖2 STAT3 在低級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(SP×400)

圖3 STAT3 在高級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(SP×400)

2.2 P16 在正常腦組織和人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)P16 蛋白表達(dá)的陽性信號主要位于胞漿中，少量位于胞核中。在10 例正常腦組織中標(biāo)本中，P16 表達(dá)全陽性。在低級別人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，P16 的陽性表達(dá)率為78.4%(29/37)，高級別組為28.95%(11/38);P16 在低級別組人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平明顯高于高級別組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)。按照秩相關(guān)法對表達(dá)水平和病理級別進(jìn)行分析，得出相關(guān)系數(shù)r =0.457，P=0.003。見圖4、5、6。

圖4 P16 在正常腦組織中的表達(dá)(SP×400)

圖5 P16 在低級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(SP×400)

圖6 P16 在高級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(SP×400)

2.3 STAT3 與P16 在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)的相關(guān)性 根據(jù)Spearman 等級相關(guān)性分析，STAT3 蛋白和P16 蛋白之間存在相關(guān)性，進(jìn)一步分析可得:r=－1.000，P ＜0.05，STAT3 與P16 在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)。見表1。

表1 ARHI 蛋白與突變型P53 蛋白等級相關(guān)圖表

3 討論

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STATs)屬于一類轉(zhuǎn)錄因子，是由酪氨酸蛋白激酶活化，介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)性和增生性信號的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子家族［3］。具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能。至今在哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的STATs 主要成員有7 個(gè)，1994年作為白細(xì)胞介素－6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的急性期反應(yīng)因子，STAT3 被提取純化出來［4－5］。有研究表明，STAT3 可以通過JAK/STAT 途徑，掌控下游多種基因的轉(zhuǎn)錄激活［6］，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化以及凋亡等過程中發(fā)揮著重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織中的膠質(zhì)細(xì)胞相比，STAT3 在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在異常的活化，提示人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生與STAT3 蛋白的異?；罨赡艽嬖谝欢ǖ南嚓P(guān)性。另外，有研究顯示［7］，STAT3 的活化在神經(jīng)干細(xì)胞的分化中發(fā)揮著重要作用，神經(jīng)干細(xì)胞中抑制STAT3 蛋白的表達(dá)可以使干細(xì)胞向神經(jīng)元的方向分化。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，STAT3 在高級別的人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平明顯要高于低級別膠質(zhì)瘤(P ＜0.05)，由此可以得出結(jié)論，隨著人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度的增加，STAT3 蛋白的表達(dá)水平也逐漸增高。

P16 基因，又叫做多腫瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1，MTS1)，定位于人類9 號染色體9p21，對細(xì)胞的生長起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用。由Kamb 等［8］在1994年首次報(bào)導(dǎo)在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株當(dāng)中存在P16 基因的丟失，隨后Carydis 等［9］又證實(shí)了P16 基因以及其表達(dá)的丟失常見于惡性程度比較高的原發(fā)性人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，P16 在低級別組人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平明顯高于高級別組人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤(P ＜0.05)，由此得出結(jié)論:隨著人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理級別以及惡性程度的增高，P16 的表達(dá)逐漸減弱。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，STAT3 在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)隨著病理級別的升高逐漸增強(qiáng)，P16 在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中隨著病理級別的升高，表達(dá)逐漸減弱。二者呈負(fù)相關(guān)性。通過大量查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，STAT3 對VEGF的表達(dá)具有調(diào)控作用，通過阻斷STAT3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能導(dǎo)致VEGF 表達(dá)的下調(diào)，從而使惡性腫瘤血管形成的能力降低。

綜上所述，隨著STAT3 和P16 及其相關(guān)性研究的逐漸深入，二者可能成為判斷人腦膠質(zhì)瘤惡性程度及預(yù)后的有效指標(biāo)，然而當(dāng)前STAT3 和P16 的協(xié)調(diào)作用和互相制約的相關(guān)機(jī)制及如何聯(lián)合靶點(diǎn)治療的機(jī)制尚待解決，但為聯(lián)合檢測、評估人腦膠質(zhì)瘤的診療提供了新的途徑和思路。

［1］王俊杰，王剛，周章明，等.神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療研究進(jìn)展［J］.癌癥進(jìn)展，2011，1(7):63－67.

［2］李少君，姚聲濤.STAT3 與腦膠質(zhì)瘤［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，9(2):990－993.

［3］Johnson H M，Noon－Song E，Ahmed C M.Controlling nuclear jaks and stats for specific gene activation by Ifn γ and other cytokines:A possible steroid－like connection［J］.J Clin Cell Immunol，2011，410(3):648－653.

［4］Liu C B，Wang R，Dong M W，et al.Expression of hepcidin at the choroid plexus in normal aging rats is associated with IL－6/Stat3 signaling pathway［J］.Sheng Li Xue Bao，2014，66(6):639－646.

［5］Tadokoro T，Wang Y，Barak L S，et al.IL－6/STAT3 promotes regeneration of airway ciliated cells from basal stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111(35):E3641－E3649.

［6］Bonetto A，Aydogdu T，Jin X，et al.JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL－6 and in experimental cancer cachexia［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2012，303(3):E410－E421.

［7］成翔，金國華，張新化，等.STAT3 基因沉默促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化［A］.中國解剖學(xué)會(huì).中國解剖學(xué)會(huì)2013年年會(huì)論文文摘匯編［C］.中國解剖學(xué)會(huì)，2013:1.

［8］Kamb A，Shattuck E D，Eeles R，et al.Analysis of the p16 gene(CDKN2)as a candidate for the chromosome 9p melanoma susceptibility locus［J］.Nat Genet，1994，8(1):23－26.

［9］Carydis V B，Walker T，Wing A，et al.Utility of p16(ink4a)immunocytochemistry in liquid－based cytology specimens from women treated for high－grade squamous intraepithelial lesions［J］.Acta Cytol，2007，51(4):517－522.