賀春語 胡曉娜 王雯 劉如 劉勁松 吳小源 王建華

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 放療中心 河南 鄭州 450008;2.河南省中醫(yī)學(xué)院三附院 醫(yī)學(xué)影像科 河南 鄭州 450008)

表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)在眾多實(shí)體瘤中過高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。EGFR 的過度激活通過下游多條信號傳導(dǎo)通路，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、分裂、增殖，其中最重要的是Ras/Raf/MEK/ERK/MARP 信號通路［2］。鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(v－ Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF)是一種癌基因，位于MARP 通道入口處，受上游Ras 蛋白激酶的調(diào)控［3］。一般情況下，當(dāng)原癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗饕ㄟ^高表達(dá)或表達(dá)功能異常的蛋白參與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。本文采用免疫組化SP 法對食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)組織中EGFR、Kras、BRAF 蛋白進(jìn)行檢測，探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集河南省腫瘤醫(yī)院2007年1月至2009年8月臨床資料完整的ESCC 病例116例及其石蠟包埋組織(手術(shù)標(biāo)本100例、胃鏡活檢病理組織16例)，其中男74例，女42例;年齡32～76 歲，中位年齡58 歲;高、中、低分化分別為28、50、38例。采用2009年AJCC 食管癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)分期，T1、T2、T3、T4期分別為26、30、46、14例，N0、N1、N2、N3期分別為52、34、21、9例，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為12、42、48、14例。選20例癌旁正常組織做對照。所有患者未接受過胸部放療、化療及其他抗腫瘤治療。

1.2 方法 116例石蠟包埋的存檔組織塊，每例重新制備厚4 μm 連續(xù)切片，貼在涂有防脫膠的載玻片上脫蠟，然后用SP 法進(jìn)行EGFR、Kras 及BRAF 免疫組化標(biāo)記，免疫組化標(biāo)記嚴(yán)格按照SP 試劑盒說明書的步驟進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判定 EGFR、Kras 及BRAF 均以細(xì)胞漿/胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為陽性細(xì)胞。免疫組織化學(xué)染色以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)特異性染色深淺來進(jìn)行評分:0 分為無色，1 分為淡黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色;再依據(jù)染色細(xì)胞所占百分比評分:陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為0 分，10%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，76%～100%為4 分。兩項(xiàng)乘積即為該例免疫組織化學(xué)得分:(－)0 分;(+)1～2 分;(+ +)3～4 分;(+ + +)5～6 分。其中，(+ )和(+ +)定為弱陽性，(+ + + )定為強(qiáng)陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同臨床病理特征間同一指標(biāo)比較采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，各指標(biāo)相關(guān)性采用Spearman 等級相關(guān)分析;檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、Kras、BRAF 在ESCC 中表達(dá) 116例患者的ESCC 組織和20例癌旁正常組織中均檢測出3 種蛋白的陽性表達(dá)，EGFR、Kras、BRAF 陽性表達(dá)率在ESCC 中表達(dá)分別為70.7%、31.0%和49.1%，均高于癌旁正常組織，其中EGFR、BRAF 在兩者中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，而Kras 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見表1。

2.2 EGFR、Kras、BRAF 的表達(dá)與ESCC 臨床病理特征的關(guān)系 EGFR、Kras、BRAF 在ESCC 中的表達(dá)與性別、年齡無關(guān)(P ＞0.05)，EGFR 表達(dá)與分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關(guān)(P ＜0.05)，而與浸潤深度無關(guān)(P ＞0.05)。BRAF 表達(dá)與浸潤深度及分期有關(guān)(P ＜0.05)，與分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P ＞0.05)。而Kras 在ESCC 中表達(dá)與分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期無關(guān)(P ＞0.05)。見表2。

表1 EGFR、Kras、BRAF 在ESCC 及其癌旁正常組織中的表達(dá)

表2 EGFR、Kras、BRAF 在ESCC 中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 ESCC 組織中EGFR 與Kras、BRAF 蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 EGFR 與Kras 在ESCC 中均陽性表達(dá)25例，無明顯相關(guān)性。而EGFR 與BRAF 表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.542，P ＜0.05，見表3。

表3 EGFR 與Kras、BRAF 表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

我國是食管癌高發(fā)國家，其年發(fā)病患者數(shù)占世界總發(fā)病患者數(shù)的60%，雖然隨著新型化療藥物的出現(xiàn)和治療手段的改進(jìn)，療效已有明顯提高，但5年生存率仍不足20%［4］。分子靶向藥物為腫瘤治療提供了新途徑，以EGFR 為靶點(diǎn)的研究最為廣泛。EGFR 屬I 型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，在正常的生理狀態(tài)下，EGFR 是細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)細(xì)胞生長、增殖、分化等生命現(xiàn)象。EGFR 過表達(dá)后，與相應(yīng)配體結(jié)合可激活細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，加速細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。研究顯示30%～90%的食管癌患者存在EGFR 過表達(dá)，正常食管上皮基底細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞僅見低表達(dá)。常佳等［5］報(bào)道87例食管鱗癌中EGFR 陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，與組織學(xué)分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期有關(guān)。本研究顯示116例食管癌組織中EGFR 的表達(dá)率為70.7%(82/116)，癌旁正常組織表達(dá)率為35% (7/20)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，表明EGFR 的高表達(dá)與食管癌發(fā)生密切相關(guān)。隨著食管癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期的增加，EGFR 蛋白表達(dá)的陽性率也隨之增加，提示EGFR有促進(jìn)食管癌生長與轉(zhuǎn)移的作用。

Kras 基因編碼21kDa 鳥苷酸結(jié)合蛋白，有3 種密切相關(guān)的Ras 蛋白，即Kras、Hras、Nras 構(gòu)成小分子GTP 酶的Ras 超家族成員，它們可作為分子開關(guān)，傳遞細(xì)胞外信號，從而引發(fā)一系列基本的細(xì)胞過程，包括增殖、存活和分化。當(dāng)前Ras 蛋白的生化模型提示，Ras以GDP 結(jié)合的非活化形式存在，當(dāng)與GTP 結(jié)合則被啟動，Kras 的啟動將進(jìn)一步激活Ras－Raf－MEK－ERK這條信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增生，促使腫瘤形成。Kras 的突變已被證實(shí)與多種腫瘤密切相關(guān)［6］。本研究發(fā)現(xiàn)kras 的陽性表達(dá)率在食管癌組織中雖高于癌旁組織，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。Kras 表達(dá)與臨床分期、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P 均＞0.05)，其在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用有待進(jìn)一步研究。

BRAF 是Ras－Raf－MEK－ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，它主要通過絲裂原活化蛋白激酶通路中的絲/蘇氨酸蛋白激酶發(fā)揮作用，此酶將細(xì)胞表面受體和Ras 蛋白通過MEK 和ERK 與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相連接，啟動多種因子參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件，如細(xì)胞生長、分化以及凋亡等。生長調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)細(xì)胞生長、增殖、分化等生命現(xiàn)象［7］。EGFR 與相應(yīng)配體結(jié)合后，可激活細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。本研究食管癌組織中BRAF 的表達(dá)遠(yuǎn)高于癌旁正常組織(P ＜0.05)，隨食管浸潤深度程度和TNM 分期的增加而升高，提示BRAF 過表達(dá)可能促進(jìn)食管癌的發(fā)生發(fā)展。

EGFR 靶向藥物在食管癌治療中取得重要進(jìn)展，但報(bào)道并不一致［8－9］。本研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中EGFR 與BRAF 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與Kras表達(dá)無關(guān)，提示我們需進(jìn)一步深入研究，闡明EGFR靶向藥物作用機(jī)制，聯(lián)合檢測EGFR 及BRAF 蛋白有助于食管癌的早期診斷，可對有效治療方案的選擇提供新的依據(jù)。

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