莆田市公安局物證鑒定所 叢雪塵 方愛瓊 方 茜

Identifiler Plus試劑盒在產(chǎn)品定位上雖不屬于直擴(kuò)試劑盒，但因其具有抗抑制能力強(qiáng)等特點(diǎn)，也具有直擴(kuò)的潛力。關(guān)于 Identifiler Plus應(yīng)用于不同類型的現(xiàn)場檢材直擴(kuò)檢驗(yàn)的可行性和有效性，已經(jīng)有文獻(xiàn)予以報(bào)道，用其對(duì)現(xiàn)場血樣進(jìn)行直擴(kuò)檢驗(yàn)的成功率和用 Identifiler-Direct進(jìn)行直擴(kuò)檢驗(yàn)的成功率無顯著差異，用其對(duì)現(xiàn)場煙蒂及擦拭物進(jìn)行直擴(kuò)檢驗(yàn)的成功率甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于用 Identifiler-Direct進(jìn)行直擴(kuò)檢驗(yàn)的成功率[1]，這進(jìn)一步表明Identifiler Plus應(yīng)用于直擴(kuò)時(shí)表現(xiàn)良好。對(duì)于煙蒂的 DNA檢驗(yàn)，有研究指出，當(dāng)煙蒂放置時(shí)間超過一周時(shí)，檢出率就將隨著放置時(shí)間的增長而大幅下降，且在用Chelex-100方法提取煙蒂DNA時(shí)，提取煙紙上DNA的檢出率要大大高于提取海綿上DNA的檢出率[2]，而在煙紙中加入海綿對(duì)檢出率沒有顯著影響[3]。筆者認(rèn)為，該結(jié)論是否同樣適用于直擴(kuò)法還需進(jìn)一步驗(yàn)證，且該驗(yàn)證非常有必要，因?yàn)檫@對(duì)日常檢案將帶來很大幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

50個(gè)煙蒂均來源于志愿者，為新鮮煙蒂。

1.2 儀器與試劑

采用ABI-9700型PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，ABI-3130XL型遺傳分析儀進(jìn)行測序；擴(kuò)增試劑使用美國 ABI公司生產(chǎn)的Identifiler Plus 試劑盒。

1.3 方法

分為直擴(kuò)組和對(duì)照組兩組。直擴(kuò)組分別剪取每枚煙蒂唾液斑痕處的外層煙紙約 2mm×1mm、海綿約 2mm×0.5mm、以及兩者混合物，剪碎后留待擴(kuò)增。擴(kuò)增試劑采用Idnetifiler Plus試劑盒，擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)體系配比與擴(kuò)增參數(shù)均參照操作說明書推薦參數(shù)設(shè)置。對(duì)照組按上述方法剪取相同檢材的煙紙海綿混合物，DNA提取采用行標(biāo)GA/T383-2014中的Chelex-100方法，擴(kuò)增試劑亦使用Idnetifiler Plus試劑盒，25μL反應(yīng)體系，反應(yīng)體系配比與擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置同直擴(kuò)組。以上兩組電泳測序信息均由Data Collection 3.0數(shù)據(jù)收集軟件自動(dòng)收集，采用GeneMapperID v3.2軟件進(jìn)行基因分型。

2 結(jié)果

從檢驗(yàn)結(jié)果看，煙紙的直擴(kuò)檢出成功率僅為12%，海綿的檢出成功率高達(dá)96%，與對(duì)照組的檢出率（98%）相比無顯著差異，在海綿中加入煙紙對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果無顯著影響（見表1）。對(duì)海綿進(jìn)行直擴(kuò)檢驗(yàn)所獲得的STR分型與用對(duì)照組相比無顯著差異，但對(duì)照組圖譜的等位基因間均衡性要稍好，STR分型比較見圖1～圖3。

表1 三種檢驗(yàn)部位的STR分型結(jié)果比較

圖1 煙紙直擴(kuò)STR分型結(jié)果

圖2 海綿直擴(kuò)STR分型結(jié)果

圖3 對(duì)照組STR分型結(jié)果

3 討論

從檢驗(yàn)結(jié)果看，對(duì)新鮮煙蒂進(jìn)行直擴(kuò)檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)選取煙蒂的海綿部分，而非煙紙部分。用直擴(kuò)法檢驗(yàn)煙蒂海綿是可行的，結(jié)果是可信的，且省去 DNA提取步驟，既節(jié)省了檢驗(yàn)時(shí)間又減少了潛在的污染環(huán)節(jié)。一些學(xué)者認(rèn)為，海綿中的纖維上含有PCR抑制物，會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率低[2]，[4]，但另一些實(shí)驗(yàn)[3]則表明，在煙紙中加入煙絲會(huì)導(dǎo)致檢驗(yàn)失敗，而加入海綿則不影響檢驗(yàn)結(jié)果。筆者認(rèn)為，海綿纖維本身對(duì)PCR的抑制作用并不顯著，而煙絲中則存在大量 PCR抑制物，只是由于吸煙者在吸煙過程中，過濾嘴海綿上可能吸附了大量煙絲燃燒殘留物，煙紙上吸附的則比較少，所以當(dāng)使用抗抑制能力不強(qiáng)的擴(kuò)增試劑盒來檢驗(yàn)海綿時(shí)，很難得到滿意的結(jié)果。Identifiler Plus試劑盒的突出特點(diǎn)便是抗抑制能力強(qiáng)，所以用其來做直擴(kuò)實(shí)驗(yàn)時(shí)，反而可能由于吸附在海綿上的脫落細(xì)胞比吸附在煙紙上的脫落細(xì)胞更容易浸泡脫落，從而檢驗(yàn)海綿的成功率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于檢驗(yàn)煙紙的成功率。對(duì)于陳舊煙蒂，吸附在煙紙和海綿上的脫落細(xì)胞更難浸泡脫落，是否適用直擴(kuò)法檢驗(yàn)還需驗(yàn)證。在本次研究中，雖然檢驗(yàn)海綿的檢出成功率很高，但所獲得STR分型的峰高及等位基因間均衡性還不甚理想，改良擴(kuò)增反應(yīng)體系或許會(huì)獲得更好的結(jié)果。在對(duì)新鮮煙蒂進(jìn)行直擴(kuò)時(shí)，還需注意，在剪取海綿時(shí)，應(yīng)選取唾液斑痕較明顯處剪取，增加模板濃度可有效提高檢出成功率；由于海綿的延展性較好，在擴(kuò)增前應(yīng)注意將剪取的檢材完全浸沒在反應(yīng)液中，避免因檢材漂浮在液面導(dǎo)致檢驗(yàn)失敗。

[1]哈飛，孫紅兵，高海鵬，等.現(xiàn)場生物檢材Identifiler Plus直接擴(kuò)增方法的應(yīng)用研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2013,21（12）：33-34.

[2]張愛平，陳曉輝，劉長暉，等.放置時(shí)間對(duì)煙蒂上DNA含量及STR分型的影響[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2008,24（6）：423-424.

[3]張慶霞，劉雅誠，唐暉，等.煙蒂DNA分型的研究[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2003,18（1）：29-30.

[4]陳向紅，劉超，李越.熒光標(biāo)記STR分型進(jìn)行煙蒂的個(gè)人識(shí)別[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2002,17（5）：301-302.