王進文 編譯

（西北橡膠塑料研究設計院有限公司，陜西 咸陽 712023）

脫除天然橡膠膠乳和手套中的蛋白質(zhì)

王進文 編譯

（西北橡膠塑料研究設計院有限公司，陜西 咸陽 712023）

采用漂洗和脫蛋白方法去除了天然橡膠中的蛋白質(zhì)。對市售天然橡膠手套進行了漂洗處理，用尿素、十二烷基硫酸鈉（SDS）和丙酮脫除工業(yè)高氨膠乳（HANR）中的蛋白質(zhì)。采用經(jīng)改進的Lowry方法和Kjeldahl方法測定了橡膠的可抽提蛋白質(zhì)含量和氮含量。經(jīng)聚焦離子束掃描電鏡（FIB/SEM）觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)漂洗后，天然橡膠手套中非橡膠成分的納米基體消失，有效降低了HANR中的可抽提蛋白質(zhì)含量和氮含量。結(jié)果表明，尿素、SDS和丙酮并用可完全脫除膠乳中的蛋白質(zhì)。

天然橡膠；膠乳；手套；蛋白質(zhì)；聚焦離子束掃描電鏡（FIB/SEM）

0 前言

過去30年里，人們開發(fā)了多種脫除天然橡膠中蛋白質(zhì)的方法：酶脫蛋白、尿素脫蛋白、十二烷基硫酸鈉（SDS）脫蛋白，以及熱水漂洗等。其中尿素和熱水漂洗兩種方法是最受重視的，其可制備低蛋白天然橡膠和無蛋白天然橡膠，可以滿足美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）的要求。采用脫蛋白方法或漂洗處理后，天然橡膠就可用于醫(yī)用產(chǎn)品、衛(wèi)生材料和制品，如手術(shù)手套、牙醫(yī)手套、衛(wèi)生手套、導尿管、醫(yī)用氣球、矯形橡膠帶、粘合膏、奶瓶奶嘴、醫(yī)用冰袋，以及烹飪手套、衣服松緊帶、化妝棉粉撲、橡膠墊等產(chǎn)品。因此，低蛋白天然橡膠和無蛋白天然橡膠可被用于一些新領域或以前不能使用的領域。

以前在分析天然橡膠結(jié)構(gòu)時，我們研究了尿素脫蛋白質(zhì)方法。研究發(fā)現(xiàn)，對于不是化學鍵合在天然橡膠上的蛋白質(zhì)，尿素可以有效地使膠粒表面上的蛋白質(zhì)變性。這些研究結(jié)果使我們在天然橡膠脫蛋白質(zhì)方面取得了技術(shù)突破；不再需要水解酶使天然橡膠中的蛋白質(zhì)變性。因此，與水解酶脫蛋白質(zhì)方法相比，用尿素脫蛋白質(zhì)具有顯著優(yōu)勢。人們可以使用各種變性劑脫蛋白質(zhì)，縮短處理時間。例如，我們將水解酶脫蛋白質(zhì)的處理時間≥24 h縮短到≤10 min尿素脫蛋白質(zhì)處理時間。此外，我們將天然橡膠的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量從約0.40%（質(zhì)量分數(shù)）降低到很低的水平。實際上，用尿素處理后，氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量低于0.01%（質(zhì)量分數(shù)）和1.0 mg/g 橡膠；而采用水解酶脫蛋白后，此二值分別為0.02%和3.2 mg/g橡膠。尿素脫蛋白質(zhì)天然橡膠的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量顯著低于水解酶脫蛋白質(zhì)天然橡膠?，F(xiàn)在，我們可以制備無蛋白質(zhì)天然橡膠，經(jīng)3次離心處理后，氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量低于0.000%和0.0 mg/g橡膠。相比之下，經(jīng)漂洗后，氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量相當高，大于0.10%和50 mg/g橡膠。

本研究中，我們采用漂洗方法將可抽提蛋白質(zhì)的含量降低到與無蛋白質(zhì)天然橡膠接近的水平。采用經(jīng)改進的Lowry方法（ISO 12243：2003）測定可抽提蛋白質(zhì)含量和氮含量。用聚焦離子束/掃描電鏡（FIB-SEM ）觀察了形態(tài)。

1 實驗

1.1 試樣和試劑

本研究所用天然橡膠樣品是工業(yè)高氨膠乳（HANR，馬來西亞Golden hope公司產(chǎn)品），以及市售天然橡膠手套A和手套B。HANR膠乳的總固體質(zhì)量分數(shù)和干膠質(zhì)量分數(shù)分別為62.1%和60.7%。十二烷基硫酸鈉（SDS）是日本Kishida有限公司產(chǎn)品。硫酸、氫氧化鈉、無水硫酸鉀、硫酸銅、硒、25%（w/v）戊二醛溶液和四氧化鋨（質(zhì)量分數(shù)4%）水溶液是日本Nacalai Tesque公司產(chǎn)品。其他試劑是分析純。

1.2 天然橡膠的純化

用0.1%的尿素、1.0%的SDS和0.025%的丙酮在室溫下處理HANR膠乳，脫除蛋白質(zhì)。乳脂部分重新分散在含有1.0% SDS和0.025%丙酮的水溶液中，制成DRC為30%的膠乳，之后離心沖洗2次。離心分離橡膠，用甲醇凝聚，再在室溫、減壓條件下干燥至恒重。將手套A（1 g）用50 ml水在各種條件下漂洗6 h 。本研究采用的溫度和pH為：40 ℃下1～10，20～100 ℃下5.5。手套A在50 ℃及減壓條件下干燥1周。

1.3 測定

按馬來西亞橡膠研究所（RRIM）試驗方法B7所述Kjeldahl方法測定橡膠中的氮含量。橡膠試樣與催化劑（硫酸鉀∶硫酸銅∶硒的質(zhì)量比為1：2：1）的混合物用濃硫酸溶解。將所得溶液蒸餾，餾分用0.005 mol/L 的硫酸滴定，甲基紅作指示劑。

通過DC蛋白質(zhì)試驗測定橡膠試樣中的可抽提蛋白質(zhì)含量。尺寸為2 cm×2 cm的橡膠試樣用磷酸緩沖液（1/15 mol/L， pH=7）抽提，比例為1 g橡膠/5 ml磷酸緩沖液。抽提時在40℃下連續(xù)攪拌6 h。之后過濾試樣，用Bio-Red DC蛋白質(zhì)分析裝置，以牛血清丙種球蛋白（BGG）作為標準，測定沉清液中的蛋白質(zhì)含量。

用透射電子顯微鏡（JEOL TEM-2100）觀察橡膠試樣的形態(tài)，加速電壓為200 kV。用于TEM觀察的超薄切片，用超薄切片機在低于試樣玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（約-80 ℃）下切取。切片厚度約為100 nm，用磷鎢酸（PTA）在室溫下染色10 min。

塊狀橡膠試樣在室溫25%戊二醛水溶液中浸泡12 h ，之后用蒸餾水沖洗1 h。最后用4% OSO4水溶液在室溫下染色48 h。用SII Nano Technology SMI-3050SE進行FIB-SEM觀察。為了防止處理過程中表面彎曲，在試樣表面沉積了一薄層碳。鎵離子束在30 kV的加速電壓下以30 nm的間隔蝕刻表面，制備斷面。在2 kV加速電壓下對斷面進行SEM觀察。由于斷面處于掃描電子顯微鏡（SEM）鏡頭的對角位，所以對所得SEM圖像進行了校正。

2 結(jié)果與討論

表1示出了天然橡膠（HANR）和脫蛋白質(zhì)天然橡膠中的氮含量，其中A代表丙酮，0.025代表丙酮的含量（0.025%質(zhì)量分數(shù)），丙酮添加到膠乳中。用尿素和SDS處理1 h，再離心分離2次后，天然橡膠中的氮含量從0.279% 降到0.021%，可抽提蛋白質(zhì)含量從115.2 μg/g橡膠下降到3.2 μg/g橡膠。脫蛋白質(zhì)天然橡膠（DPNR）的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量與酶解脫蛋白質(zhì)天然橡膠的非常類似（膠乳用水解酶和SDS處理24 h以上，之后離心分離2次）。處理時間大幅縮短，這是因為采用尿素作為變性劑，未使用水解酶。例如，尿素使蛋白質(zhì)變性時，由于氫鍵斷裂使高級結(jié)構(gòu)變形；而采用水解酶時，由于水解而產(chǎn)生酰化作用。

膠乳用尿素、丙酮和SDS處理1 h，再離心分離2次后，氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量進一步降低到0.000%和0.0 μg/g橡膠。換言之，用尿素、丙酮和SDS將天然橡膠中的蛋白質(zhì)完全除去了。這可能是由于丙酮是油脂和脂肪酸的良溶劑（圖1）。油脂和脂肪酸可能從膠粒上脫落，在水溶液相形成膠團，可能會使膠粒中產(chǎn)生自由空間。在用尿素和SDS變性后，自由空間可能會使蛋白質(zhì)更容易從天然橡膠上脫離，這是因為氫鍵斷裂后蛋白質(zhì)的體積收縮了。釋放出來的蛋白質(zhì)被尿素和SDS穩(wěn)定在水相中，這是因為蛋白質(zhì)的憎水部分被尿素和SDS覆蓋。因此，去除油脂和脂肪酸后膠粒結(jié)構(gòu)松散，蛋白質(zhì)會自然脫落。所得純化天然橡膠據(jù)稱是無蛋白質(zhì)橡膠，因為其不含蛋白質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，需要離心分離2次才可以將天然橡膠中的蛋白質(zhì)除掉。

表1 天然橡膠（HANR）、脫蛋白質(zhì)天然橡膠（DPNR）和無蛋白質(zhì)天然橡膠（PFNR）的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量

圖1 用尿素、極性溶劑和SDS從天然橡膠中脫除蛋白質(zhì)的示意圖

表2示出了天然橡膠手套A和手套B（市售產(chǎn)品）的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量。手套A和手套B的氮含量值類似。但是手套A的可抽提蛋白質(zhì)含量是手套B的2倍?？沙樘岬鞍踪|(zhì)含量值顯著高于美國FDA推薦的標注值（＜50 μg/g橡膠）。因此，手套A和手套B不符合法規(guī)要求，不能出口到美國。本研究中，我們用手套A作為漂洗試驗的試樣，因為其氮含量值和可抽提蛋白質(zhì)含量分別大于0.2%和600 μg/g橡膠。

表2 天然橡膠手套A和天然橡膠手套B的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量

圖2所示為天然橡膠（HANR）、無蛋白質(zhì)天然橡膠和手套A的透射電子顯微鏡（TEM）照片。暗區(qū)是蛋白質(zhì)，亮區(qū)是天然橡膠［蛋白質(zhì)由磷鎢酸（PTA）進行了染色］。由圖2（A）可清楚地看出，HANR擁有納米基質(zhì)結(jié)構(gòu)，主要組分是平均直徑約為1 μm的天然橡膠粒子，蛋白質(zhì)基體平均厚度約為15 nm。從HANR中脫除蛋白質(zhì)后，納米基質(zhì)結(jié)構(gòu)消失，這由無蛋白質(zhì)天然橡膠［圖2（B）］的TEM照片可以看出。這說明，天然橡膠中含有蛋白質(zhì)時會出現(xiàn)納米基質(zhì)結(jié)構(gòu)。納米基質(zhì)的厚度可能取決于蛋白質(zhì)的含量。

圖2 HANR（A）、無蛋白質(zhì)天然橡膠（PFNR）（B）和天然橡膠手套A（C）的TEM圖像

手套A也具有納米基體結(jié)構(gòu)，如圖2（C）所示。手套A 的納米基體結(jié)構(gòu)幾乎與HANR的相同；例如，納米基體的厚度約為15 nm。這可能是因為與HANR一樣，手套A具有較高的氮含量（0.251%）和可抽提蛋白質(zhì)含量（692 μg/g橡膠）。這證明手套A 含有大量的蛋白質(zhì)，足以形成納米基體結(jié)構(gòu)。

圖3所示為手套A 漂洗試驗中可抽提蛋白質(zhì)含量與pH的關(guān)系；漂洗在40 ℃下進行6 h。可抽提蛋白質(zhì)含量顯著取決于漂洗試驗的pH。pH為1.9時，漂洗后，可抽提蛋白質(zhì)含量從692 μg/g橡膠下降到86 μg/g橡膠；pH大于6.8時，則蛋白質(zhì)含量低于200 μg/g橡膠。相比之下，pH為4.0和5.5時，手套A 漂洗后的蛋白質(zhì)含量為633 μg/g橡膠和611 μg/g橡膠，與未處理手套A的可抽提蛋白質(zhì)含量692 μg/g橡膠相近。手套A 可抽提蛋白質(zhì)含量隨漂洗試驗中pH而變化，這可能與天然橡膠中存在的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有關(guān)。例如40 ℃下，在pH 4到6之間的條件下，橡膠蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，這是因為橡膠蛋白質(zhì)的等電點在酸度系數(shù)（pKa）約為4處。水相中不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)可能會返回橡膠粒子表面，會使可抽提蛋白質(zhì)含量增大。天然橡膠手套在使用過程中也可能會發(fā)生同樣的情況。在中溫條件下，蛋白質(zhì)可能不能從手套中抽提出來，因為人類皮膚的pH為4.5到6.0，溫度約為40 ℃。但是，出汗后，從手套中抽出的蛋白質(zhì)量可能會增大，因為汗的pH為7.0～8.0。這樣就會產(chǎn)生膠乳過敏問題。例如，以前的研究表明，在接觸手套A 這種高蛋白含量天然橡膠手套時，身體健康的人發(fā)生膠乳過敏的比率為30%。此外，我們發(fā)現(xiàn)，溫度40 ℃不足以從天然橡膠中脫除蛋白質(zhì)，不能達到FDA的標識要求值，即50 μg/g橡膠。

圖3 天然橡膠手套A可抽提蛋白質(zhì)含量隨pH的變化

pH對手套A 氮含量的影響示于圖4。氮含量幾乎與漂洗pH無關(guān)（在40 ℃下漂洗6 h）。這意味著天然橡膠手套表面的蛋白質(zhì)量與蛋白質(zhì)總量相比很少。但是嚴格地說，在pH 4.0和pH 5.5條件下漂洗時，漂洗后手套A的氮含量稍高。氮含量較高可能與可抽提蛋白質(zhì)含量較高有關(guān)，說明漂洗后保留了大量的蛋白質(zhì)。漂洗后，氮含量＜0.2%，比手套A（0.251%）的低。所以脫除的蛋白質(zhì)量約為天然橡膠中存在的蛋白質(zhì)總量的20%。因而證實漂洗只能有效脫除橡膠手套表面的蛋白質(zhì)。

圖5所示為在pH 5.5及不同溫度條件下漂洗6 h后的可抽提蛋白質(zhì)含量。在20 ℃和40 ℃下漂洗6 h后，可抽提蛋白質(zhì)含量較高，說明在漂洗過程中脫除的蛋白質(zhì)較少。相比之下，在60 ℃、80 ℃和100 ℃下漂洗時，可抽提蛋白質(zhì)含量低于200 μg/g橡膠，大約是未處理時的1/3。從圖5和圖3的結(jié)果可看出，漂洗的適宜條件是溫度高于60 ℃，pH大于7.0。圖6示出了在pH 5.5及各種溫度條件下漂洗6 h后手套A的氮含量。在20 ℃下漂洗后，手套A氮含量未發(fā)生變化，但在高于40 ℃下漂洗后，氮含量降低到0.2%以下。所以漂洗溫度是天然橡膠脫除蛋白質(zhì)的重要因素，而且60 ℃是一個關(guān)鍵溫度，該溫度下可脫除20%～30%的蛋白質(zhì)。

圖4 天然橡膠手套A氮含量隨pH的變化

圖5 天然橡膠手套A可抽提蛋白質(zhì)含量隨溫度的變化

圖6 天然橡膠手套A氮含量隨溫度的變化

手套A和漂洗后手套A的FIB-SEM圖像示于圖7。漂洗在pH 5.5及不同溫度下進行6 h。暗區(qū)是天然橡膠，亮區(qū)是非橡膠組分，如蛋白質(zhì)和磷脂。未漂洗手套A作為參比試樣，用Ga離子從表面蝕刻20 μm深后，觀察到了納米基體結(jié)構(gòu)。直經(jīng)約1 μm的橡膠粒子均勻分散在非橡膠組分（如蛋白質(zhì)和磷脂）的納米基體中。從FIBSEM（圖7）觀察到的納米基體結(jié)構(gòu)與TEM（圖2）所觀察到的相同，說明從表面到內(nèi)部都均勻地形成了這種納米基體結(jié)構(gòu)。手套A在20 ℃下漂洗后納米基體結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，因為氮含量與可抽提蛋白質(zhì)含量未改變。但是，手套A在60 ℃和80 ℃漂洗后納米基體結(jié)構(gòu)消失，在FIBSEM圖像中未觀察到雜合結(jié)構(gòu)。假定手套A 的厚度為1 mm，漂洗時從表面脫除20%的蛋白質(zhì)，則估計是脫除了表面深度100μm以內(nèi)的蛋白質(zhì)。脫除蛋白質(zhì)表面層的估計厚度與圖7所示結(jié)果一致，圖7表明，漂洗后，從表面到20 μm深未觀察到雜合結(jié)構(gòu)。證明在特定條件下（溫度高于70 ℃，pH大于7），漂洗可以有效地從橡膠的表面脫除蛋白質(zhì)。

圖7 天然橡膠手套A在漂洗前（A）， 以及在20 ℃（B）、60 ℃（C）和80 ℃（D）下漂洗后的FIB-SEM照片

3 結(jié)論［1］

在各種條件下制備了無蛋白質(zhì)天然橡膠和漂洗天然橡膠手套，用TEM和FIB-SEM觀察其形態(tài)。無蛋白質(zhì)天然橡膠的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量分別為0.000%和0.0μg/g橡膠，漂洗天然橡膠手套的相應值為0.175%和86μg/g橡膠。研究發(fā)現(xiàn)，制備無蛋白質(zhì)天然橡膠時需要進行2次離心分離。脫除蛋白質(zhì)后非橡膠組分的納米基體結(jié)構(gòu)消失，無蛋白質(zhì)天然橡膠的整個斷面以及漂洗手套的表面（表面以下深20μm）未觀察到雜合結(jié)構(gòu)，但脫除蛋白質(zhì)前存在著這種結(jié)構(gòu)。

［1］ Lina Fukuhara. Removal of Proteins from Natural Rubber Latex and Gloves［J］. Kautsckwk Gummi Kunststoffe，2015， 68（3）:24-28.

［責任編輯：翁小兵］

TQ 337

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1671-8232（2015）11-0026-05

2015-07-28

王進文（1967— ），男，陜西澄城人，教授級高級工程師，主要從事期刊審校、信息及專業(yè)翻譯工作，發(fā)表論文及譯著近60篇。