賀海輝 沈 洪 朱宣宣 顧培青 劉亞軍 朱 磊 鄭 凱

(湖南省直中醫(yī)醫(yī)院，湖南 株洲 412000)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)發(fā)病多與遺傳、環(huán)境及免疫反應異常有關，病因和發(fā)病機制至今尚未被完全闡明;其病程遷延，易反復發(fā)作，嚴重影響生活質(zhì)量，且有癌變傾向。但目前仍未得到與人類UC病因、發(fā)病機制、病理改變、臨床表現(xiàn)及病程發(fā)展完全相似的理想模型。本文采用2，4，6-三硝基苯磺酸 (TNBS)/乙醇法給予大鼠灌腸，以建立較為接近的UC研究模型。

1 材料和方法

1.1材料 健康成年雄性SD大鼠20只，體重(202±5)g，由江蘇省中醫(yī)院藥理實驗室實驗動物中心提供。5%TNBS:美國Sigma公司生產(chǎn)，批號080M5000，購于上海Sigma-Aldrich生物技術(shù)有限公司;10%水合氯醛:國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號20090922;無水乙醇:南京寧試化學試劑有限公司，批號20100118;大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-10酶聯(lián)免疫檢測試劑盒:美國R＆D公司產(chǎn)品，由上海朗頓生物科技有限公司進口分裝。電子秤(型號MODEL DS-671):上海寺岡電子有限公司產(chǎn)品;電子分析天平(型號FA1004):上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品;酶標儀(型號SUNRISE):瑞士TECAN公司產(chǎn)品;恒溫箱(型號HPX-9052MBE):上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠產(chǎn)品;低溫冷凍離心機(型號Labofuge 400R):Thermo electron公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1大鼠分組及造模方法 20只大鼠隨機分成正常組、模型組，每組10只。模型組大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，用大鼠灌胃針管由肛門輕緩插入約8 cm，緩慢推入造模液(100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 ml)，保持倒立30 s后，仰臥歸籠。正常組給予相應體積的生理鹽水灌腸。

1.2.2取材 10 d后，所有大鼠禁食24 h，脫頸椎處死，迅速取出結(jié)腸，沿腸系膜緣剪開腸腔，用等滲生理鹽水漂洗腸組織，將其平鋪于冰盤上，肉眼觀察結(jié)腸大體形態(tài)。取結(jié)腸病變最嚴重處，置4%甲醛中固定后，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察組織病理學情況。

1.2.3一般情況觀察 每天觀察大鼠體重、大便(大便性狀、血便等)、進食量、精神狀態(tài)、皮毛變化、活動情況等。根據(jù)給藥結(jié)束后大鼠體重變化(較實驗開始時體重變化百分比)、大便性狀和血便情況，參照Cooper等〔1〕方法進行疾病活動指數(shù)(DAI)評分并稍作修改。體重下降:無，0分;1% ～5%，1分;5% ～10%，2分;10% ～15%，3分;＞15%，4分。大便性狀:正常大便，0分;稀糊便，2分;水樣便，4分。血便:無肉眼血便，0分;肉眼血便，4分。

1.2.4結(jié)腸大體形態(tài)損傷觀察 觀察結(jié)腸充血、潰瘍、腸壁增厚情況，參照文獻〔2〕進行結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分。無損傷，0分;充血但無潰瘍，1分;充血且腸壁變厚，但無潰瘍，2分;有1處潰瘍但無腸壁增厚，3分;有2處或2處以上潰瘍或炎癥，4分;有2處或2處以上大潰瘍和炎癥或有1處潰瘍和炎癥沿結(jié)腸縱軸超過1 cm，5分;沿結(jié)腸縱軸損傷超過2 cm以上，每超過1 cm增加1分，6～10分。

1.2.5結(jié)腸組織病理學檢查 光鏡下觀察結(jié)腸組織病理學改變，參照文獻〔3〕進行結(jié)腸組織病理學評分。上皮細胞:正常形態(tài)，0分;有杯狀細胞丟失，1分;杯狀細胞大面積丟失，2分;隱窩細胞丟失，3分;隱窩細胞大面積丟失，4分。炎癥細胞浸潤:沒有浸潤，0分;浸潤在隱窩基底層，1分;浸潤到達黏膜肌層，2分;浸潤深入到黏膜肌層，伴隨黏膜增厚和明顯水腫，3分;浸潤到達黏膜下層，4分。

1.3統(tǒng)計學處理 應用SPSS10.0軟件行t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗。

2結(jié)果

2.1一般情況 正常組大鼠反應靈敏，毛發(fā)有光澤，飲食正常，無腹瀉及便血。經(jīng)TNBS灌腸蘇醒后的大鼠，精神萎靡，少動，毛發(fā)雜亂無光澤，飲食量減少，出現(xiàn)不同程度的腹瀉及便血。處死前模型組大鼠體重〔(200.00±13.09)g〕顯著低于正常組〔(280.00±7.45)g〕(P＜0.01)。模型組大鼠 DAI評分〔(2.38±1.51)分〕明顯高于正常組(0分)(P＜0.01)。

2.2結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分 正常組大鼠結(jié)腸大體形態(tài)正常，腸道無縮短，黏膜表面光滑、光澤，未見充血水腫、糜爛潰瘍，腸壁無增厚。模型組大鼠可見結(jié)腸腸道縮短，無粘連，腸管積氣積糞，腸黏膜表面有顆粒感、質(zhì)脆，呈連續(xù)性充血水腫并可見糜爛潰瘍灶，部分大片剝脫，腸壁增厚。模型組大鼠結(jié)腸大體形態(tài)評分〔(2.94±0.94)分〕顯著高于正常組(0分)(P＜0.01)。

2.3結(jié)腸組織病理學評分 正常組大鼠鏡下觀察組織形態(tài)正常，結(jié)腸壁各層結(jié)構(gòu)清晰，未見水腫、糜爛及潰瘍形成，間質(zhì)少量淋巴細胞浸潤。模型組大鼠結(jié)腸組織可見黏膜層、黏膜下層廣泛潰瘍形成，大量中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，腺體破壞，結(jié)構(gòu)紊亂，杯狀細胞減少，隱窩結(jié)構(gòu)扭曲，隱窩炎癥及膿腫形成。模型組大鼠結(jié)腸組織病理學評分〔(6.00±1.67)分〕顯著高于正常組(0分)(P＜0.01)。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理圖片(HE，×100)

3討論

TNBS與乙醇誘發(fā)大鼠結(jié)腸炎的主要機制為乙醇破壞結(jié)腸黏膜屏障，TNBS滲入結(jié)腸作為半抗原與大分子物質(zhì)結(jié)合，形成全抗原引起腸壁一系列免疫應答與炎癥反應，其發(fā)病機制與人類 UC 相似〔4〕。Yoshimitsu等〔5〕報道，TNBS誘導的 SD 大鼠結(jié)腸組織干擾素(IFN)-γ升高，屬于 Th1型炎癥模型。Strober等〔6〕認為，Th1型炎癥反應以透壁性炎癥、偶伴肉芽腫形成為主，符合人類CD病理學特征。張濤等〔7〕觀察體重(200±20)g的清潔級雄性SD大鼠，給予100 mg/kg TNBS/乙醇灌腸后，可以誘導大鼠結(jié)腸炎癥伴潰瘍形成，且潰瘍主要在黏膜層，類似于人的UC病理特點。

與其他造模方法相比，采用TNBS/乙醇法建立UC模型有如下優(yōu)勢:①操作簡單，不需預先致敏動物或進行外科手術(shù)，而且重現(xiàn)率高;②該模型的持續(xù)時間較長，體現(xiàn)急性炎癥及潰瘍向慢性轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程，這一較長的病變過程對于評價藥物療效及研究急性炎癥向慢性轉(zhuǎn)化的病理變化頗為有用;③該模型組織學變化與人類UC相似，可見肥大細胞和淋巴細胞浸潤及隱窩炎和隱窩變形;④TNBS價格相對不高，實驗花費不大〔8〕。

對于UC與Th細胞亞型的關系，研究者們有不同的意見。很多人認為UC與Th2細胞密切相關〔9〕。但是有研究〔6〕認為，在人類UC雖然IL-5分泌明顯增加，IL-4卻未見明顯增加。而近來另有研究〔10〕顯示，UC是Th1和Th2共同作用的結(jié)果，在早期可能 Th1反應增強，而晚期以 Th2反應占優(yōu)勢。Sawa等〔11〕通過檢測UC患者腸道各種細胞因子mRNA的擴增，發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12p40、IFN-γ 和 TNF-α 等的表達都明顯比正常組高。Melgar等〔12〕認為UC中T細胞分化成Th2、Th17及調(diào)節(jié)性T細胞?？梢奤C與Th細胞亞型的關系尚不明確，根據(jù)TNBS誘導的SD大鼠結(jié)腸炎屬于Th1型炎癥模型〔5〕，推斷出此模型更適于CD的研究不可靠。

綜上所述，雖然動物試驗并非是人體疾病的最好研究模型，但在目前未得到與人類UC病因、發(fā)病機制、病理改變、臨床表現(xiàn)及病程發(fā)展完全相似的理想模型的情況下，采用TNBS/乙醇法建立UC模型為較接近的研究模型。

1 Cooper HS，Murthy SN，Shah RS，et al.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis〔J〕.Lab Invest，1993;69(2):238-49.

2 Luk HH，Ko JK，F(xiàn)ung HS，et al.Delineation of the protective action of zinc sulfate on ulcerative colitis in rats〔J〕.Eur J Pharmacol，2002;443(1-3):197-204.

3 Obermeier F，Dunger N，Strauch UG，et al，et al.Contrasting activity of cytosin-guanosin dinucleotide oligonucleotides in mice with experimental colitis〔J〕.Clin Exp Immunol，2003;134(2):217-24.

4 Morris GP，Beck PL，Herridge MS，et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon〔J〕.Gastroenterology，1989;96(3):795-803.

5 Yoshimitsu M，Hayamizu K，Egi H，et al.The neutrophil/Th1 lymphocyte balance and the therapeutic effect of granulocyte colony-stimulating factor in TNBS-induced colitis of rat strains〔J〕.J Interferon Cytokine Res，2006;26(5):291-300.

6 Strober W，F(xiàn)uss IJ，Blumberg RS.The immunology of mucosal models of inflammation〔J〕.Annu Rev Immunol，2002;20(5):495-549.

7 張 濤，謝建群.大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的實驗研究〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2006;14(4):240-2.

8 王 皓，歐陽欽，胡仁偉.三硝基苯磺酸結(jié)腸炎動物模型的建立〔J〕.胃腸病學，2001;6(1):7-10.

9 Lakatos L.Immunology of inflammatory bowel diseases〔J〕.Acta Physiol Hung，2000;87(4):355-72.

10 龐艷華，鄭長青.Th1/Th2細胞亞群與炎癥性腸病的關系〔J〕.世界華人消化雜志，2004;12(8):1922-4.

11 Sawa Y，Oshitani N，Adachi K，et al.Comprehensive analysis of intestinal cytokine messenger RNA profile by real-time quantitative polymerase chain reaction in patients with inflammatory bowel disease〔J〕.Int J Mof Med，2003;11(2):175-9.

12 Melgar S，Shanahan F.Inflammatory bowel disease-from mechanisms to treatment strategies〔J〕.Autoimmunity，2010;43(7):463-77.