張煥云，吳 卓，戴佳佳，秦懿偲，李金泉，楊 旭（華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079）

DINP皮膚暴露對(duì)小鼠過(guò)敏性皮膚炎癥的佐劑作用

張煥云，吳 卓，戴佳佳，秦懿偲，李金泉，楊 旭*（華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079）

為了探究新型增塑劑鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）對(duì)小鼠過(guò)敏性皮膚炎癥的影響，采用皮膚染毒的暴露方式，56只SPF級(jí)雄性Balb/C小鼠隨機(jī)平均分為7組處理40d.用0、1.4、14和140mg/kg DINP對(duì)小鼠進(jìn)行皮膚染毒，并用抗氧化劑褪黑素設(shè)置2組來(lái)探究氧化應(yīng)激的介導(dǎo)作用，以及1組生理鹽水對(duì)照組.染毒結(jié)束后取耳組織測(cè)定耳腫指數(shù)和雙耳重量差，并制作耳組織病理學(xué)切片，最后檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo).實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 14和140mg/kg DINP皮膚暴露組的皮膚炎癥有明顯加?。≒＜0.01），氧化應(yīng)激指標(biāo)也有明顯變化（P ＜0.01）.這表明，一定濃度的DINP，經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間的暴露，對(duì)小鼠過(guò)敏性皮膚炎癥具有明顯的佐劑作用.并且，隨著DINP濃度升高，小鼠機(jī)體氧化應(yīng)激過(guò)度活化，造成機(jī)體組織或細(xì)胞的氧化損傷，并加劇了炎癥反應(yīng).

鄰苯二甲酸二異壬酯；過(guò)敏性皮膚炎癥；皮膚暴露；佐劑效應(yīng)；氧化損傷

鄰苯二甲酸酯類(lèi)增塑劑（PAEs）是一類(lèi)廣泛應(yīng)用于塑料產(chǎn)品中的化學(xué)助劑，在增塑劑市場(chǎng)中占主導(dǎo)地位［1-2］.但如使用不當(dāng)，將會(huì)對(duì)人體健康造成危害［3-7］.

DINP是一種新型PAEs類(lèi)增塑劑.DINP代謝物可通過(guò)生物介質(zhì)檢測(cè)到，如血液、尿液［8］. DINP在生殖發(fā)育毒性方面比傳統(tǒng)增塑劑安全許多，但目前對(duì)其非生殖發(fā)育毒性的研究甚少.有研究表明，如果人類(lèi)長(zhǎng)期使用含PAEs類(lèi)物質(zhì)的護(hù)膚品，尿液中相關(guān)代謝物水平會(huì)明顯升高［9］.鑒于世界各國(guó)對(duì)新型增塑劑的推廣，對(duì)其非生殖發(fā)育毒性的研究很有必要.

丹麥學(xué)者Larsen等［10-11］對(duì)DEHP（一種傳統(tǒng)PAEs類(lèi)增塑劑）的毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)DEHP對(duì)小鼠的氣道炎癥有一種“環(huán)境佐劑效應(yīng)”.研究者普遍認(rèn)為PAEs類(lèi)增塑劑對(duì)機(jī)體產(chǎn)生各種傷害的原因在于其對(duì)細(xì)胞的氧化損傷作用，并且不少實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一觀點(diǎn)的正確性［12-14］.然而，鮮有研究涉及到DINP對(duì)小鼠過(guò)敏性皮膚炎癥的影響，并將DINP導(dǎo)致組織和細(xì)胞氧化損傷與其過(guò)敏性皮炎的影響聯(lián)系起來(lái).因此，本實(shí)驗(yàn)選擇研究DINP對(duì)小鼠過(guò)敏性皮膚炎癥的影響，希望為今后的深入研究做出一定的貢獻(xiàn).

皮膚接觸是DINP常見(jiàn)的暴露方式之一［15］，但往往也易忽視.人造化學(xué)品很可能是近年來(lái)人類(lèi)過(guò)敏性疾病發(fā)病率上升的主要因素［16-17］.有研究指出，室內(nèi)降塵中PAEs污染需引起關(guān)注［18］.因此，本文研究了DINP經(jīng)皮膚暴露時(shí)對(duì)小鼠過(guò)敏性皮炎的影響，對(duì)于相關(guān)職業(yè)的特殊人群預(yù)防過(guò)敏性疾病具有參考意義.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Balb/C小鼠，5～6周齡，體重（22±1.5）g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)所提供.實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先對(duì)小鼠進(jìn)行一周的適應(yīng)性喂養(yǎng).

1.1.2 主要儀器 5415R低溫冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、FLx800熒光酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）、DM 4000B電子顯微鏡（德國(guó)Leica公司）、HH-42三用電熱恒溫水箱（北京市長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)儀器廠）、MSI渦旋儀（IKA公司）、DNM-9602酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）、-70℃冰箱（日本三洋）.

1.1.3 主要試劑 鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP，美國(guó)Sigma-Aidrich公司）、異硫氰酸熒光素（FITC，美國(guó)Sigma-Aidrich公司）、丙酮（美國(guó)Sigma-Aidrich公司）、吐溫80（美國(guó)Amresco公司）、4%多聚甲醛溶液（美國(guó)Sigma-Aidrich公司）、2，7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA，美國(guó)Sigma-Aidrich公司，純度大于97%）、硫代巴比妥酸（TBA，上海試劑二廠），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí).GSH和蛋白質(zhì)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所.

1.2 染毒方法

1.2.1 DINP濃度的選擇 根據(jù)美國(guó)消費(fèi)品安全委員會(huì)（CPSC）規(guī)定，DINP的人的每日耐受量為0.12mg/（kg·d）［19］，根據(jù)小鼠與人用藥量換算公式得出，DINP的小鼠的每日耐受量為1.4mg/kg.所以，選取1.4mg/kg為本實(shí)驗(yàn)的最低染毒濃度.同時(shí)，按照1:10比例等比增加兩個(gè)染毒濃度，即14和140mg/kg DINP，用來(lái)模擬高濃度DINP暴露條件，檢測(cè)其暴露后的毒性效應(yīng).

1.2.2 溶液的配制 （1）DINP染毒液的配制:DINP與吐溫80按照1:1的比例混勻，然后用滅菌的生理鹽水將其配制成140mg/kg的原液，原液用生理鹽水稀釋后得到14mg/kg、1.4mg/kg的染毒液.每天皮膚涂抹DINP的體積與小鼠體重的比值是4μL/g（此比例時(shí)染毒液不易滴下）.因此配制50mL 140mg/kg DINP: 1.8mL DINP+ 1.8mL吐溫80 + 46.4mL生理鹽水.（2）0.5%FITC的配制:0.5%FITC （W/V） 致敏劑是以FITC為溶質(zhì)，DBP和丙酮（1:1）為溶劑均勻混合而成，室溫超聲混勻并現(xiàn)配現(xiàn)用.單純使用0.5% FITC不能使小鼠成為敏感模型，DBP充當(dāng)著必要的誘導(dǎo)作用［20］.（3）褪黑素溶液（MT， 30mg/kg）:MT溶液體積與小鼠體重的比值為10μL/g，用3%的無(wú)水乙醇助溶.如配10mL MT溶液:30mg MT+9.7mL生理鹽水+300μL無(wú)水乙醇.

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將56只Balb/C小鼠隨機(jī)平均分為7組，每組8只.A組: 生理鹽水皮膚暴露+溶劑對(duì)照（DBP和丙酮1:1配制）染毒；B組: 生理鹽水皮膚暴露+0.5% FITC致敏；C 組: 1.4mg/（kg·d） DINP皮膚暴露+0.5%FITC致敏；D組: 14mg/（kg·d）DINP皮膚暴露+0.5%FITC致敏；E組: 140mg/（kg·d）DINP皮膚暴露+0.5%FITC致敏；F組:140mg/（kg·d）皮膚暴露+0.5% FITC + MT；G組:生理鹽水皮膚暴露+0.5%FITC+MT.

1.3 DINP皮膚暴露動(dòng)物模型的建立

將7組小鼠分別在背部減去大致相同面積的毛發(fā)并每天分別涂抹0、1.4、14、140mg/kg劑量的DINP，一共涂抹40d.第41～42d，A組和G組腹部涂抹120μL對(duì)照溶劑，B-F組的腹部涂抹120μL 0.5%FITC進(jìn)行致敏.第47d時(shí)，B-F組的右耳涂抹20μL 0.5%FITC進(jìn)行激發(fā)，左耳涂對(duì)照溶劑.A組和G組的左右耳均涂對(duì)照溶劑.F組和G組為MT保護(hù)組，以灌胃的方式攝入相同濃度的MT（圖1）.

圖1 實(shí)驗(yàn)分組與染毒流程Fig.1 The experimental groups and the exposure process

1.4 耳腫脹程度的檢測(cè)

耳腫脹程度用耳腫指數(shù)和雙耳重量差來(lái)表示，分別使用電子游標(biāo)卡尺和分析天平測(cè)量.小鼠耳腫指數(shù)用48d時(shí)小鼠左右耳同一位置厚度差來(lái)表示；分別用8mm打孔器在小鼠雙耳對(duì)稱(chēng)位置取下相同大小的耳部組織，分析天平稱(chēng)重并計(jì)算小鼠雙耳質(zhì)量差.

1.5 耳組織病理學(xué)檢測(cè)和細(xì)胞計(jì)數(shù)

耳腫脹程度檢測(cè)結(jié)束之后，取小面積右耳組織于室溫下用4%的多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，H&E染色，DM 4000B電子顯微鏡下觀察右耳組織的病理組織學(xué)變化.我們通過(guò)對(duì)H&E染色切片的細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)分析細(xì)胞浸潤(rùn)的情況.

1.6 組織勻漿和氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)

1.6.1 組織勻漿的制備 收集小鼠右耳組織，將小鼠右耳組織在預(yù)冷的PBS （pH7.5） 中漂洗，濾紙拭干，然后在冰上用玻璃勻漿器將耳組織和預(yù)冷的PBS進(jìn)行勻漿，制成10%勻漿液，于4℃，10000r/min離心后取上清，保存于-70℃冰箱，用于氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、GSH和MDA的檢測(cè).

1.6.2 活性氧（ROS）水平的檢測(cè) 細(xì)胞中ROS含量是反映細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平的主要指標(biāo).過(guò)量的活性氧物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用.ROS含量采用DCF熒光法測(cè)定.將上清液用PBS稀釋500倍，將濃度為10mmoL/L的DCFHDA熒光染料用PBS稀釋1000倍，各取100μL于酶標(biāo)板中排列，在37℃條件下避光反應(yīng)10min后，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量其在485nm激發(fā)光，528nm發(fā)射光下的熒光強(qiáng)度.

1.6.3 還原型谷胱甘肽（GSH）含量和蛋白含量的測(cè)定 GSH可以和ROS結(jié)合形成硫代半縮醛，并通過(guò)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)生成具更強(qiáng)抗氧化作用的抗壞血酸.GSH含量和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定均要嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行.

1.6.4 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定 過(guò)量的ROS還可使脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物之一，其水平高低代表脂質(zhì)過(guò)氧化的強(qiáng)度.MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）法.取0.5mL10%的小鼠肺組織勻漿于10mL離心管中，加入2mL 0.6%的TBA溶液，之后將所有離心管置于沸水浴中，在沸水浴期間，MDA可以與TBA反應(yīng)生成粉紅色的發(fā)色團(tuán).沸水浴15min后取出所有離心管，并迅速將其放置于流動(dòng)的冷水中降溫，待樣品冷卻之后，取出離心管，吸取1mL混合液，在10000r/min條件下離心10min.離心完畢，取200μL于酶標(biāo)板中排列，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀分別在450、532和600nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，最后按照公式計(jì)算MDA含量:

式中:A為吸光度.

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），隨后采用LSD法進(jìn)行兩兩對(duì)比，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.用于表示結(jié)果的柱狀圖均是由GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)分析軟件繪圖.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 耳腫脹程度

通過(guò)測(cè)量雙耳的耳腫指數(shù)和雙耳重量差來(lái)反映小鼠的耳部腫脹程度.

圖2和圖3分別展示了小鼠耳腫指數(shù)和雙耳質(zhì)量差.與A組相比，B-E組小鼠右耳出現(xiàn)均明顯腫脹現(xiàn)象；與B組相比，D、E組的小鼠耳腫脹程度更嚴(yán)重，DINP濃度越高，耳腫脹越嚴(yán)重；與E組相比，F(xiàn)組小鼠耳腫脹程度明顯減輕，具有極顯著性差異（P＜0.01）.

圖2 小鼠雙耳耳腫指數(shù)的結(jié)果Fig.2 The result of ear swelling index*:P＜0.05， **:P＜0.01，與A組相比；#:P＜0.05， ##:P＜0.01，與B組相比；&&:P＜0.01，E組與F組相比

圖3 小鼠雙耳耳重差的結(jié)果Fig.3 The result of difference of bilateral ear weight**:P＜0.01，與A組相比；##:P＜0.01，與B組相比；&&:P＜0.01，E組與F組相比

2.2 耳組織病理學(xué)H&E染色切片及細(xì)胞計(jì)數(shù)

本實(shí)驗(yàn)小鼠耳組織的病理學(xué)變化通過(guò)H&E染色切片來(lái)表現(xiàn)，用以反應(yīng)小鼠耳組織腫脹以及細(xì)胞浸潤(rùn)情況，并結(jié)合IPP軟件對(duì)H&E染色的切片進(jìn)行了細(xì)胞計(jì)數(shù)，直觀的反映細(xì)胞浸潤(rùn)的情況（如圖4所示，黑色箭頭表示細(xì)胞浸潤(rùn)）.A組小鼠耳組織并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的病理學(xué)變化和細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象；與A組相比，B-E組的小鼠右耳耳腫脹現(xiàn)象明顯并隨著DINP暴露濃度的升高而加重；同時(shí)，細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量出現(xiàn)明顯增多，最嚴(yán)重的組為E組，可見(jiàn)明顯的藍(lán)色染色細(xì)胞核，細(xì)胞計(jì)數(shù)具有極顯著差異（P＜0.01）；與E組相比，F(xiàn)組小鼠耳組織耳腫脹程度明顯減輕，細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量也顯著減少（P＜0.05）.

圖4 小鼠耳部組織H&E染色和細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)數(shù)結(jié)果Fig.4 The mice ear organization H&E staining and the counting result of cell infiltration**:P＜0.01，與A組相比；#:P＜0.05，與B組相比；&:P＜0.05，E與F組相比；黑色箭頭:細(xì)胞浸潤(rùn)

2.3 耳組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)

2.3.1 ROS水平的檢測(cè) 圖5是各組小鼠右耳組織的ROS含量檢測(cè)結(jié)果.可以看出:與A組相比，D、E組ROS含量明顯升高，具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）；與B組相比，D、E組ROS含量明顯升高，且具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）；F組與E組相比， ROS含量明顯降低，且具有極顯著差異（P＜0.01）.

2.3.2 GSH水平的檢測(cè) 圖6表示的是小鼠右耳GSH含量的檢測(cè)結(jié)果，可以看出:與A組相比，B組GSH含量明顯降低，具有顯著性差（P＜0.05），C、D、E組GSH含量明顯降低，具有極顯著差異（P＜0.01）；與B組相比，D組和E組GSH含量均明顯降低，且具有極顯著性差異（P＜0.01）；F組與E組相比，GSH含量明顯升高，且具有極顯著差異（P＜0.01）.

圖5 小鼠右耳ROS含量的結(jié)果Fig.5 The result of ROS content in mice right ears *:P＜0.05， **:P＜0.01，與A組相比；#:P＜0.05， 與B組相比；&&:P＜0.01，E組與F組相比

圖6 小鼠右耳GSH含量的結(jié)果Fig.6 The result of GSH content in mice right ears*:P＜0.05， **:P＜0.01，與A組相比；##:P＜0.01，與B組相比；&&:P＜0.01，E組與F組相比

圖7 小鼠右耳MDA含量的結(jié)果Fig.7 The result of MDA content in mice right ears*:P＜0.05， **:P＜0.01，與A組相比；##:P＜0.01，與B組相比；&:P＜0.05，E組與F組相比

2.3.3 MDA水平的檢測(cè) 圖7是MDA含量的檢測(cè)結(jié)果:與A組相比，D，E組MDA含量明顯升高，具有顯著性差（P＜0.05，P＜0.01）；與B組相比，E組MDA含量明顯升高，具有極顯著差異（P＜0.01）；F組與E組相比，MDA含量明顯降低，且具有極顯著差異（P＜0.01）.

3 討論

3.1 小鼠耳腫脹程度和組織病理學(xué)變化

耳腫脹程度是本實(shí)驗(yàn)中最直接的觀測(cè)指標(biāo)，也是評(píng)價(jià)該暴露模型嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)之一［21］.在40d的DINP（14和140mg/kg）皮膚暴露后，小鼠對(duì)于過(guò)敏原的刺激更為敏感，表現(xiàn)在耳腫脹程度加重、耳部組織結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重等方面.這些變化直觀地向我們展示了DINP長(zhǎng)期皮膚暴露的危害.

3.2 小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

單純過(guò)敏原刺激或在低濃度DINP輔佐下引起的小鼠過(guò)敏性皮炎并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激效應(yīng).但是，在高濃度DINP輔佐作用下，炎癥反應(yīng)加重到一定程度時(shí)，就會(huì)引起小鼠組織和細(xì)胞氧化應(yīng)激效應(yīng)增強(qiáng)，并造成氧化損傷，導(dǎo)致ROS和MDA含量升高，GSH含量下降.褪黑素是一種重要的脂溶性抗氧化劑，在本研究中，高劑量染毒+褪黑素和生理鹽水+褪黑素與高劑量組和生理鹽水組相比較，右耳的ROS、MDA的含量均有所下降，GSH含量上升，說(shuō)明發(fā)生炎癥的小鼠體內(nèi)確實(shí)產(chǎn)生了氧化損傷.

4 結(jié)論

一定濃度的DINP，經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間的暴露，對(duì)小鼠過(guò)敏性皮膚炎癥具有明顯的佐劑作用，能夠明顯增強(qiáng)小鼠的皮膚炎癥；這種毒性作用可被MT所拮抗.表明氧化應(yīng)激/損傷途徑在小鼠皮膚炎癥反應(yīng)中起介導(dǎo)作用.

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致謝：感謝環(huán)境生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的精心指導(dǎo)和大力支持；感謝實(shí)驗(yàn)室所有的師兄師姐給予本項(xiàng)目的支持和幫助.感謝本項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)不懈奮斗、堅(jiān)持到底的所有成員.最后，向在科研實(shí)驗(yàn)中犧牲的小白鼠致敬！

Adjuvant effect of skin DINP exposure on mice with allergic dermatitis.

ZHANG Huan-yun， WU Zhuo， DAI Jia-jia，QIN Yi-cai， LI Jin-quan， YANG Xu*（School of Life Sciences， Central China Normal University， Wuhan 430079， China）. China Environmental Science， 2015，35（12）：3804～3809

In order to explore the effect of a new plasticizer-di-isononyl phthalate （DINP） on mice allergic skin inflammation， we used skin exposure method. Fifty six male Balb/C mice were divided into seven groups， in which four groups and exposed to 0， 1.4， 14 and 140mg/kg DINP， two other groups administrated antioxidant melatonin were set to explore oxidative stress effects， and one group was set as saline control. After exposure， the indexes of ear swelling and the weight difference of bilateral ear were determined， and we observed the pathology change through the ear pathology slice. The biomarkers about oxidative stress were tested too. The results showed that the 14and 140mg/kg DINP worsen skin inflammation significantly （P＜0.01）， and the oxidative stress indexes also changed obviously （P＜0.01）. These results suggest that a certain concentration of DINP can significantly increase related symptom of skin inflammation caused by allergen. It certifies that a certain concentration DINP has obvious adjuvant effect on allergic skin inflammation in mice. In addition， along with the concentration of DINP increase， the oxidative stress in the bodies of mice is overactive and it causes organism tissues or cells oxidative damage and contributes to the inflammatory response.

di-isononyl phthalate （DINP）；allergic dermatitis；skin exposure；adjuvant effect；oxidative damage

X18，R994.6

A

1000-6923（2015）12-3804-06

張煥云（1992-），女，山東濟(jì)寧人，華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院在讀本科生.

2015-05-12

華中師范大學(xué)教育部資助大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（51136002）

* 責(zé)任作者， 教授， yangxu@mail.ccnu.edu.cn